開(kāi)發(fā)出冰凍組織高通量單細(xì)胞核測(cè)序方法，繪制人腦第二代單細(xì)胞圖譜

　　大腦是人體中最為復(fù)雜的器官，盡管它有著巨大作用，但是人們對(duì)其功能仍了解甚微。據(jù)估計(jì)，人類(lèi)大腦擁有約 1000 億個(gè)神經(jīng)元分布于不同腦區(qū)，形成極度復(fù)雜的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。另外腦內(nèi)還有數(shù)目比神經(jīng)元更多的膠質(zhì)細(xì)胞。傳統(tǒng)的細(xì)胞分類(lèi)方法只能根據(jù)少數(shù)已知細(xì)胞的分子標(biāo)記進(jìn)行分類(lèi)，對(duì)每一類(lèi)大腦細(xì)胞的認(rèn)識(shí)也非常有限。

　　隨著分子技術(shù)的發(fā)展，基于不同類(lèi)型細(xì)胞的基因表達(dá)模式差異，科學(xué)家通常利用單細(xì)胞 RNA 測(cè)序，對(duì)細(xì)胞類(lèi)型進(jìn)行鑒定，確定神經(jīng)元的亞型，進(jìn)而為構(gòu)建完整大腦細(xì)胞圖譜奠定基礎(chǔ)。今年 10 月 16 日，“人類(lèi)細(xì)胞圖譜計(jì)劃”(the Human Cell Atlas) 首批擬資助的 38 個(gè)項(xiàng)目正式公布。這一大型國(guó)際合作項(xiàng)目致力于建立一個(gè)健康人體所包含的所有細(xì)胞的參考圖譜，并以此加深對(duì)疾病診斷、監(jiān)測(cè)、治療的了解 。

　　但目前，構(gòu)建完整的大腦細(xì)胞圖譜仍受到多種條件的限制。首先，科學(xué)家仍需要一種高通量且無(wú)偏差的單細(xì)胞檢測(cè)方法，而不受樣本新鮮程度和活細(xì)胞分離的限制。此外，盡管轉(zhuǎn)錄組表達(dá)譜可以發(fā)現(xiàn)不同細(xì)胞類(lèi)型在復(fù)雜組織中的功能差異，但仍需更多維度的人腦單細(xì)胞檢測(cè)技術(shù)，以揭示不同人腦細(xì)胞中更全面的基因表達(dá)和調(diào)控信息。

　　加州大學(xué)圣地亞哥分校張鹍教授團(tuán)隊(duì) 2016 年在 Science 上發(fā)表了**個(gè)成年人腦單細(xì)胞神經(jīng)元表達(dá)譜。近日，該團(tuán)隊(duì)在 Nature Biotechnology 上發(fā)表了一個(gè)基于全新單細(xì)胞核測(cè)序方法的成年人腦第二代單細(xì)胞圖譜，再次引爆了單細(xì)胞研究的熱點(diǎn)。

　　首先，研究團(tuán)隊(duì)將視線(xiàn)聚焦于腦組織提取的神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞單細(xì)胞核，克服了樣本的限制，使該方法可以應(yīng)用于新鮮或凍存的腦組織，實(shí)現(xiàn)了凍存組織的大規(guī)模單細(xì)胞檢測(cè)，且不受組織細(xì)胞解離的影響。另外，這項(xiàng)研究的一個(gè)創(chuàng)新之處在于結(jié)合了兩種新一代高通量單細(xì)胞技術(shù)：基于微流體的單核測(cè)序(snDrop-seq)和單細(xì)胞轉(zhuǎn)座體超敏性位點(diǎn)測(cè)序(scTHS-seq)的方法，不僅能利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析鑒定不同功能的細(xì)胞類(lèi)型，還能通過(guò)表觀遺傳特征更好地描述這些表達(dá)譜是如何調(diào)節(jié)或維持的，從而提供一個(gè)更全面的單細(xì)胞圖譜。

　　該研究中，基于微流體的單核測(cè)序技術(shù)(snDrop-seq)，不僅可以對(duì)成千上萬(wàn)個(gè)單細(xì)胞同時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，從多方面對(duì)細(xì)胞類(lèi)型和細(xì)胞狀態(tài)進(jìn)行分類(lèi)，還可用于評(píng)估新鮮和凍存人體組織中的特異性表達(dá)譜，有助于研究組織的功能異質(zhì)性。值得一提的是，該技術(shù)還攻克了在微滴中有效裂解核膜而不引起 RNA 過(guò)度降解的難題。

　　為同時(shí)研究表觀遺傳特征，該團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)了 scTHS-seq 技術(shù)。scTHS-seq 擁有具有體外轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增的線(xiàn)性?xún)?yōu)勢(shì)和改造后的超級(jí)突變 Tn5 轉(zhuǎn)座酶，比 ATAC-seq 靈敏度更高，還提高了對(duì)被認(rèn)為高度細(xì)胞特異性的遠(yuǎn)端增強(qiáng)子 (distal enhancers) 的覆蓋率。

　　研究團(tuán)隊(duì)聯(lián)合應(yīng)用以上兩種互補(bǔ)的方法最終建立了這種可并行檢測(cè)細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄本和表觀遺傳特征的高通量測(cè)序平臺(tái)，為綜合分析凍存人體組織樣本中基因表達(dá)和調(diào)節(jié)提供了途徑。研究人員用此方法檢測(cè)了超過(guò) 60,000 個(gè)來(lái)自成人大腦皮層和小腦的單細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)了 35 種不同的神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞亞型。值得一提的是，去年 Science 發(fā)表的**代圖譜因?yàn)榧夹g(shù)限制忽略了各種類(lèi)型的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。現(xiàn)在，這些膠質(zhì)細(xì)胞在新一代圖譜里得到了完整的描述。

　　此外，他們還將常見(jiàn)的人腦遺傳疾病相關(guān)的遺傳位點(diǎn)定位到特定的細(xì)胞類(lèi)型，揭示了大腦中哪些細(xì)胞類(lèi)型更易受腦部疾病遺傳因子的影響。例如，他們發(fā)現(xiàn)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的兩種亞型小膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞分別是阿爾茨海默病遺傳因子的**和第二突破口。

　　張鹍教授表示，關(guān)于腦部疾病的發(fā)病根源有多種理論，我們的發(fā)現(xiàn)有助于確定大腦中哪種類(lèi)型的細(xì)胞最容易受到遺傳風(fēng)險(xiǎn)因子的攻擊。我們的最終目標(biāo)是繪制一個(gè)完整的人腦細(xì)胞圖譜。目前，研究小組正計(jì)劃進(jìn)一步擴(kuò)大研究范圍來(lái)繪制大腦其他區(qū)域的細(xì)胞圖譜。

　　隨著前不久前“人類(lèi)細(xì)胞圖譜”計(jì)劃的開(kāi)展，單細(xì)胞測(cè)序的研究熱情必然持續(xù)高漲。這種方法無(wú)疑為研究人類(lèi)大腦的復(fù)雜機(jī)理、構(gòu)建完整大腦細(xì)胞圖譜提供了基礎(chǔ)。我們可以相信，未來(lái)這種綜合的多組學(xué)方法必將在復(fù)雜器官和組織的單細(xì)胞研究中發(fā)揮愈發(fā)強(qiáng)大的作用。