利用CRISPRCas9誘導(dǎo)的DNA瘢痕序列追蹤細(xì)胞譜系

如今，諸如RNA測序之類的技術(shù)正在揭示出哪些基因在每個(gè)細(xì)胞中表達(dá)。隨后，科學(xué)家們就能夠利用類似的表達(dá)譜對所有的細(xì)胞進(jìn)行系統(tǒng)性地分類。德國馬克斯-德爾布呂克分子醫(yī)學(xué)中心數(shù)量發(fā)育生物學(xué)研究小組負(fù)責(zé)人Jan Philipp Junker博士說，“當(dāng)我們使用這種技術(shù)研究器官或有機(jī)體時(shí)，我們不僅發(fā)現(xiàn)熟悉的細(xì)胞類型，我們也會(huì)發(fā)現(xiàn)未知的和罕見的細(xì)胞類型。下一個(gè)問題很明顯---這些不同的細(xì)胞類型來自于何處？”針對于這一點(diǎn)，在一項(xiàng)新的研究中，Junker團(tuán)隊(duì)開發(fā)出一種被稱作LINNAEUS（lineage tracing by nuclease-activated editing of ubiquitous sequence, 通過對普遍存在的序列進(jìn)行核酸酶激活的編輯來開展譜系追蹤）的技術(shù)，它能夠讓人們確定細(xì)胞類型和每個(gè)細(xì)胞的譜系。相關(guān)研究結(jié)果于2018年4月9日在線發(fā)表在Nature Biotechnology期刊上，論文標(biāo)題為“Simultaneous lineage tracing and cell-type identification using CRISPR–Cas9-induced genetic scars”。

Junker說，“我們想要理解有機(jī)體發(fā)育的靈活性。”如果在胚胎發(fā)育期間發(fā)生損傷（比如，由突變或環(huán)境影響導(dǎo)致的損傷），那么修復(fù)機(jī)制就應(yīng)確保動(dòng)物在以后看起來顯得健康。僅每個(gè)細(xì)胞的譜系才能夠揭示損傷程度和修復(fù)機(jī)制的真實(shí)情形。即便是成年斑馬魚的心臟在遭受損傷后也能夠再生。Junker說，“這是生物學(xué)發(fā)育過程在自我重復(fù)，還是有新的事物出現(xiàn)？細(xì)胞是否會(huì)發(fā)生改變并承擔(dān)其他任務(wù)？”在某些情況下，一種細(xì)胞類型的缺失可導(dǎo)致特定疾病。在未來，科學(xué)家們將能夠使用LINNAEUS可追蹤的所有細(xì)胞譜系樹，并針對這些問題提出新的假說。

快速修復(fù)會(huì)導(dǎo)致瘢痕序列產(chǎn)生

這種技術(shù)基于DNA中的瘢痕序列（scar sequence），這些瘢痕序列當(dāng)匯總在一起時(shí)就像條形碼一樣發(fā)揮作用，能夠確定每個(gè)細(xì)胞的譜系。雖然斑馬魚胚胎仍處于單細(xì)胞階段，但是Junker團(tuán)隊(duì)給這些胚胎注入CRISPR-Cas9系統(tǒng)。在接下來的8個(gè)小時(shí)內(nèi)，Cas9重復(fù)性地切割斑馬魚從不需要的基因序列：編碼紅色熒光蛋白（RFP）的基因。這些斑馬魚胚胎產(chǎn)生的紅色熒光逐漸消失，而且數(shù)千個(gè)瘢痕序列在DNA損傷區(qū)域中形成。Junker說，“CRISPR總是在確切的位點(diǎn)上進(jìn)行切割。但是，在下一次細(xì)胞分裂發(fā)生之前，這些細(xì)胞的修復(fù)時(shí)間不超過15分鐘。這種修復(fù)工作必須快速完成，這樣染色體片段就會(huì)連接在一起。這也是錯(cuò)誤發(fā)生的地方。DNA中的瘢痕序列具有隨機(jī)的長度，而且它們的確切位置也會(huì)發(fā)生變化。”子細(xì)胞在細(xì)胞分裂過程中遺傳這些瘢痕序列。因此，源自相同祖先的細(xì)胞能夠通過它們的遺傳性瘢痕序列來加以鑒定。

盡管單細(xì)胞RNA測序可依據(jù)細(xì)胞類型繪制數(shù)千個(gè)細(xì)胞的圖譜，但是這些瘢痕序列表明這些細(xì)胞之間存在著數(shù)百萬個(gè)連接。利用這些數(shù)據(jù)重建細(xì)胞譜系樹面臨著各種各樣的挑戰(zhàn)。有些瘢痕序列是特別可能會(huì)發(fā)生的。Junker說，“這是危險(xiǎn)的，這是因?yàn)槿绻嗤鸟：坌蛄卸荚谛呐K細(xì)胞和腦細(xì)胞中產(chǎn)生，那么人們就可能會(huì)錯(cuò)誤地認(rèn)為它們具有相同的祖先。因此我們必須知道哪些瘢痕序列是不值得我們信任的，并將它們?yōu)V除掉。”此外，論文共同**作者、馬克斯-德爾布呂克分子醫(yī)學(xué)中心生物信息學(xué)家Bastiaan Spanjaard說，并非細(xì)胞中的所有瘢痕序列都是能夠找到的。“因此，我們開發(fā)出一種方法來彌合能夠讓我們構(gòu)建出細(xì)胞譜系樹所需的數(shù)據(jù)上的差距。”

聚焦數(shù)據(jù)集

最終的結(jié)果是構(gòu)建出具有彩色餅圖的細(xì)胞譜系樹，并在餅圖上進(jìn)行分支劃分。每個(gè)劃分都是依據(jù)瘢痕序列，餅圖上的每種顏色指出這個(gè)劃分是在哪個(gè)細(xì)胞類型中發(fā)生的。研究人員能夠根據(jù)他們想要的細(xì)節(jié)聚焦這個(gè)非常大型數(shù)據(jù)集的緊湊表示。

Junker說，“比如，在心臟中，有兩種細(xì)胞類型是幾乎沒有區(qū)別的。但是這些細(xì)胞譜系樹表明它們的發(fā)育很早就在不同的方向上發(fā)生分叉。我們接下來想要觀察這些細(xì)胞類型存在于斑馬魚心臟中的何處。這通常為它們發(fā)揮何種功能提供首個(gè)指示。”他的實(shí)驗(yàn)室正在繼續(xù)使用斑馬魚作為模式生物開展研究，但是Junker也認(rèn)為將該技術(shù)應(yīng)用于人體類器官中具有巨大的潛力。這最終能夠幫助人們理解患者中的哪些突變會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞譜系樹遭受**性損傷。