協(xié)調(diào)瞬時基因表達的基礎

第24屆歐洲動物細胞技術協(xié)會（ESACT）會議論文：細胞，培養(yǎng)，患者，產(chǎn)品

題目：協(xié)調(diào)瞬時基因表達的基礎：從DNA制備（通過培養(yǎng)基、試劑和細胞系開發(fā)）到整體工藝優(yōu)化

文獻出處：BMC Proceedings. 2015, 9 (Suppl 9)
:P18

https://doi.org/10.1186/1753-6561-9-S9-P18

背景

瞬時基因表達（TGE）有四方面的影響因素：首先，必須有易于轉(zhuǎn)染的細胞系，能高豐度表達和懸浮培養(yǎng)（1）。其次，鑒于只有少數(shù)商品化細胞培養(yǎng)基支持瞬時轉(zhuǎn)染和表達，強烈建議選擇最合適的培養(yǎng)基（2）。第三，質(zhì)粒DNA的質(zhì)量、來源和骨架有重要影響[3]。第四，選擇合適的轉(zhuǎn)染試劑對于高產(chǎn)起著重要作用。

在這項工作中，我們總結(jié)了我們最近開發(fā)的一種新型的TGE系統(tǒng)，用于在HEK細胞中進行有效的瞬時轉(zhuǎn)染和表達。InVivo BioTech Services與emp Biotech公司合作開發(fā)了一種極低細胞毒性的轉(zhuǎn)染試劑，與Xell AG合作設計了可用于轉(zhuǎn)染和生產(chǎn)的培養(yǎng)基。建立TGE優(yōu)化的HEK細胞系（HEK-INV）和用于相應載體的大規(guī)模質(zhì)粒制備的方法完善了優(yōu)化的生產(chǎn)平臺。它易于應用，可擴展，并支持大規(guī)模轉(zhuǎn)染，可在幾天內(nèi)產(chǎn)生克級的IgG。

材料與方法

哺乳動物細胞在XellvivoTM培養(yǎng)基（貨號861-0001，Xell AG）中培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染，伴隨條件為37℃、5％CO2、185rpm攪拌速度和50mm軌道直徑。轉(zhuǎn)染方法如下：2μgDNA/細胞+INVect轉(zhuǎn)染試劑（貨號FK-0101-M001.0-001，emp Biotech GmbH）轉(zhuǎn)染5×106細胞/ mL，其中INVect與DNA的比例為6：1（w / w）；或轉(zhuǎn)染試劑采用25kDa L-PEI，PEI與DNA比例2：1（w / w），8mL培養(yǎng)液，50mL生物反應管。IgG1的表達分別在125mL轉(zhuǎn)瓶中的30mL培養(yǎng)液或500mL轉(zhuǎn)瓶中的150mL培養(yǎng)液中進行，并用蛋白A親和層析定量。定向進化是參考Majors等人2009年的研究[4]進行。具體來說，是進行了數(shù)輪的迭代進化，隨后進行了**性狀分析、細胞篩選和細胞回收。相應的流式細胞術分析采用了Bio-Rad S3細胞分選儀。

與微型制備規(guī)模的商業(yè)試劑盒相比，我們對幾種大腸桿菌菌株和培養(yǎng)基進行了小規(guī)模的篩選，以與商品化試劑盒相比，獲得高產(chǎn)、高質(zhì)和DNA制備的靈活性。采用了可重復使用且可規(guī)模升級的陰離子交換器進行純化。對于大規(guī)模質(zhì)粒制備，采用了?ktaprime色譜系統(tǒng)對6L懸浮液進行了裂解、澄清和純化。最后，用DoE軟件和方法對TGE過程進行了優(yōu)化。

結(jié)果

使用在三種不同培養(yǎng)基中培養(yǎng)的，在產(chǎn)量和質(zhì)量方面比較至少兩種質(zhì)粒。

對于不同的大腸桿菌菌株，我們比較了三種培養(yǎng)基和至少兩種質(zhì)粒，評價了質(zhì)粒產(chǎn)量和質(zhì)量。在質(zhì)量方面，超螺旋單體DNA的量高度依賴于宿主菌株，絕對產(chǎn)量則受培養(yǎng)基的影響。采用了陰離子交換法進行了純化。4次獨立的試驗顯示，產(chǎn)量平均為40mg質(zhì)粒DNA / 每L培養(yǎng)液（圖1A）。

然而，出乎意料的是，高達50,000 EU/ mL的內(nèi)毒素水平似乎不影響細胞活力、轉(zhuǎn)染效率，對生產(chǎn)能力也沒有顯著影響。

從哺乳動物培養(yǎng)的基礎培養(yǎng)基開始，我們與Xell AG公司合作，開發(fā)了支持瞬時轉(zhuǎn)染和高滴度表達的新型培養(yǎng)基。通過逐步篩選和優(yōu)化培養(yǎng)基組分實現(xiàn)了更高的細胞生長，轉(zhuǎn)染效率和生產(chǎn)能力。最終的培養(yǎng)基配方使IgG1的生產(chǎn)力提高了4倍（圖1B）。

我們利用定向進化，篩選出用于TGE過程的優(yōu)化的宿主細胞系。與親本宿主細胞系相比，其IgG1的生產(chǎn)力增加了3倍（圖1C）。

常用的轉(zhuǎn)染試劑如聚乙烯亞胺（PEI）在較高濃度時具有較大的細胞毒性。這使**的可轉(zhuǎn)染細胞密度受到限制，因為轉(zhuǎn)染時需要約0.5pgDNA/細胞。要達到類似的生產(chǎn)水平，25kDa L-PEI需要更大的細胞培養(yǎng)容器。新開發(fā)的INVect轉(zhuǎn)染試劑對哺乳動物細胞的瞬時轉(zhuǎn)染顯示出低細胞毒性，并且具有極高轉(zhuǎn)染效率，24小時后最高達90％。與25kDa線性PEI相比，INVect轉(zhuǎn)染后細胞目的蛋白的表達量更高，IgG生產(chǎn)力升高了2倍（圖1D）。

所有開發(fā)方面的組合可采取兩種過程策略。一方面，INVect的低毒性和新培養(yǎng)基系統(tǒng)的性能允許在高細胞密度（約1-4x107細胞/ mL）下轉(zhuǎn)染和培養(yǎng)，實現(xiàn)高達850mg/L的抗體滴度（表1）。另一方面，有可能以高密度（約4x107細胞/ mL）建立**個高產(chǎn)量偽灌注TGE生產(chǎn)過程，這使得每個反應器體積和每天的**空間時間產(chǎn)率高達200mg IgG。

表1. 在具有不同設置和規(guī)模的獨立實驗中瞬時表達單克隆抗體

*最終抗體濃度in perfundate

結(jié)論

總之，InVivo的TGE系統(tǒng)包括發(fā)達的細胞系和載體系統(tǒng)、新型轉(zhuǎn)染試劑以及獨特的定制培養(yǎng)基，所有這些都協(xié)同優(yōu)化，可高效生產(chǎn)重組蛋白。這種流水線工藝是應用在早期開發(fā)階段，下一步即產(chǎn)物鑒定以及臨床試驗前的克級規(guī)模生產(chǎn)。

此外，還開發(fā)了一種偽灌注TGE方法，用于生產(chǎn)有毒或不穩(wěn)定的產(chǎn)品，如酶或疫苗。最后，采用了濃縮定制的養(yǎng)料補充劑的生產(chǎn)工藝更簡明，使抗體滴度高達850mg/L。隨后對轉(zhuǎn)染增強劑的篩選顯示出有希望的結(jié)果并表明更進一步改進的潛力。

參考文獻

1. Hacker DL, Kiseljak D, Rajendra Y, Thurnheer S, Baldi L, Wurm FM: Polyethyleneimine-based transient gene expression processes for suspension-adapted HEK-293E and CHO-DG44 cells. Protein Expr Purif. 2013, 92: 67-76.

2. Geisse S: Reflections on more than 10 years of TGE approaches. Protein Expr Purif. 2009, 64: 99-107.

3. Rozkov A, Larsson B, Gillstrom S, Bjornestedt R, Schmidt SR: Large-scale production of endotoxin-free plasmids for transient expression in mammalian cell culture. Biotechnol Bioeng. 2008, 99: 557-566.

4. Majors BS, Chiang GG, Betenbaugh MJ: Protein and Genome Evolution in Mammalian Cells for Biotechnology Applications. Mol Biotechnol. 2009, 42: 216-223.