用于轉(zhuǎn)染和單細(xì)胞培養(yǎng)的化學(xué)限定培養(yǎng)基

2015年第24屆歐洲動(dòng)物細(xì)胞技術(shù)學(xué)會(huì)年會(huì)

題目：用于轉(zhuǎn)染和單細(xì)胞培養(yǎng)的化學(xué)限定培養(yǎng)基

BMC Proceedings20159 (Suppl 9) :P27

https://doi.org/10.1186/1753-6561-9-S9-P27

背景

先進(jìn)的培養(yǎng)基和補(bǔ)料開(kāi)發(fā)已經(jīng)多次證明了其提高生物工藝效率的潛力。通過(guò)應(yīng)用這種先進(jìn)的化學(xué)限定和無(wú)動(dòng)物成分配方，結(jié)合最新的細(xì)胞系，哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物的產(chǎn)量被推進(jìn)到每升2克。本文介紹了用于轉(zhuǎn)染和單細(xì)胞生長(zhǎng)的專用培養(yǎng)基的設(shè)計(jì)進(jìn)展。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染在基礎(chǔ)科研、藥物原料生產(chǎn)、個(gè)體醫(yī)學(xué)和疫苗生產(chǎn)上都有應(yīng)用。瞬時(shí)基因有效表達(dá)的規(guī)模升級(jí)，需要同時(shí)支持細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)染的雙功能培養(yǎng)基。

材料與方法

在96孔板中觀察了化學(xué)限定的無(wú)動(dòng)物源培養(yǎng)基對(duì)單細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，并與含血清培養(yǎng)基進(jìn)行了比較。單細(xì)胞的生長(zhǎng)通過(guò)Cellavista高通量細(xì)胞成像和分析工作站進(jìn)行分析，并對(duì)不同的CHO細(xì)胞系進(jìn)行了克隆選擇和規(guī)模升級(jí)（擴(kuò)大到轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)）。亞克隆細(xì)胞表達(dá)的重組蛋白分離后用ELISA定量，并進(jìn)行了活性測(cè)定。

對(duì)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，開(kāi)發(fā)的培養(yǎng)基配方在CHO細(xì)胞和人細(xì)胞系上進(jìn)行了測(cè)試。轉(zhuǎn)染效率用陽(yáng)離子多聚體轉(zhuǎn)染試劑盒和GFP表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行評(píng)估。對(duì)轉(zhuǎn)染后采用分批培養(yǎng)、流加培養(yǎng)和偽灌注培養(yǎng)的HEK細(xì)胞系表達(dá)IgG1抗體進(jìn)行了調(diào)查，蛋白A聯(lián)合HPLC進(jìn)行抗體定量。被陽(yáng)離子試劑轉(zhuǎn)染的細(xì)胞密度通常為3×106細(xì)胞/ml，表達(dá)GFP或IgG1的質(zhì)粒為2pgDNA/細(xì)胞。轉(zhuǎn)染期間細(xì)胞培養(yǎng)體積為4ml~1000ml。

結(jié)果

結(jié)果顯示，不同的單細(xì)胞能成功的從96孔板擴(kuò)增至24孔板，再到細(xì)胞培養(yǎng)瓶和轉(zhuǎn)瓶。采用有限稀釋法得到的細(xì)胞存在個(gè)體差異，所篩選的細(xì)胞克隆表現(xiàn)出不同的生長(zhǎng)和表達(dá)性能。8個(gè)有代表性的細(xì)胞克隆最高密度為1.9×106/ml至8.5×106次方/ml，表達(dá)的蛋白產(chǎn)量和活性存在3倍的差異。無(wú)動(dòng)物源細(xì)胞培養(yǎng)基對(duì)應(yīng)的克隆效率仍高于含血清的培養(yǎng)基。

對(duì)于瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，研發(fā)的HEK轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基支持穩(wěn)定的細(xì)胞生長(zhǎng)，使分批培養(yǎng)的細(xì)胞保持高密度（最高為16X106 細(xì)胞/ml）和高存活率，在轉(zhuǎn)染時(shí)使用新鮮培養(yǎng)基，對(duì)于不同的HEK細(xì)胞系，轉(zhuǎn)染效率為68%-94%。對(duì)于一種待評(píng)估的CHO細(xì)胞系，效率達(dá)75%-92%（見(jiàn)圖1A）。成功的小規(guī)模偽灌注培養(yǎng)顯示該方法的可行性，并且可應(yīng)用于生物反應(yīng)器。對(duì)于不穩(wěn)定的產(chǎn)物如特異性的酶，該灌流過(guò)程令人關(guān)注。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染用的一款商品化培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞表達(dá)的單克隆抗體滴度為90-150mg/L，而用研發(fā)的Xell培養(yǎng)基，可使單抗滴度升高至310-430mg/L,平均升高了3.1倍。在轉(zhuǎn)染后使用優(yōu)化的流程和合適的培養(yǎng)基，可使產(chǎn)量進(jìn)一步升高至750 - 850 mg/L。和對(duì)照的培養(yǎng)基相比，升高了6.7倍（見(jiàn)圖1B）。

圖1. 轉(zhuǎn)染效率總覽。A. 使用開(kāi)發(fā)的Xell培養(yǎng)基。盡管該培養(yǎng)基專為HEK細(xì)胞設(shè)計(jì)，但對(duì)另一種人細(xì)胞系和CHO-K1也支持高效轉(zhuǎn)染。B. 轉(zhuǎn)染基因表達(dá)的單克隆抗體量。Xell開(kāi)發(fā)的培養(yǎng)基和一款商品化培養(yǎng)基進(jìn)行了比較。