細(xì)胞狀態(tài)不好，你排除過支原體嗎？（上）

1、支原體的分離培養(yǎng)

  它是支原體污染鑒定的金標(biāo)準(zhǔn)，準(zhǔn)確，價(jià)格便宜。但支原體在分離培養(yǎng)的過程中，要長出明顯克隆至少需要4周時(shí)間，所需時(shí)間較長。

2、ELISA方法

  檢測(cè)步驟復(fù)雜，出現(xiàn)誤差的幾率較高，對(duì)實(shí)驗(yàn)者操作技巧有要求。同時(shí)試劑盒成本較高，普遍不被選用。

3、DNA熒光染色法

  它采用熒光染色劑Hoechst 33258和支原體DNA富含A-T的區(qū)域結(jié)合。價(jià)格適中。由于DNA檢測(cè)需要將可疑樣品與指示細(xì)胞共同培養(yǎng)，因此一般需要幾天后才出結(jié)果。有假陽性和假陰性，需要與其他方法結(jié)合使用。

4、PCR技術(shù)

它根據(jù)支原體核糖體16s-23s rRNA的特異保守序列設(shè)計(jì)引物，對(duì)待檢樣本DNA進(jìn)行擴(kuò)增，通過對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物的大小分析作出診斷（見下圖）。操作簡(jiǎn)單、速度快，只需2-3小時(shí)即可出結(jié)果，通量高，價(jià)格適中。但是，不同廠家生產(chǎn)的PCR檢測(cè)試劑盒由于引物及內(nèi)在設(shè)計(jì)的不同，其準(zhǔn)確度和敏感度有天壤之別。

目前，被全球各大實(shí)驗(yàn)室及生物藥廠普遍選用的是德國Minerva Biolabs公司開發(fā)生產(chǎn)的支原體PCR檢測(cè)試劑盒。試劑盒在267bp的條帶，涵蓋了歐洲《藥典》中最易感染細(xì)胞的26種支原體亞型，保證了其超強(qiáng)的敏感度；通過內(nèi)控條帶的設(shè)計(jì)，防止了假陰性的發(fā)生。我國農(nóng)業(yè)部在2008年豬藍(lán)耳病疫苗研制的重點(diǎn)項(xiàng)目中，實(shí)驗(yàn)者用此檢測(cè)法與培養(yǎng)法做了超過100次的平行比對(duì)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果全部一致，假陽性率和假陰性率為零。

因此，用PCR方法檢測(cè)支原體，其準(zhǔn)確性與選擇的試劑盒的質(zhì)量有直接相關(guān)性。

圖：有支原體污染的樣本在267bp位置有陽性條帶。Internal Control為內(nèi)部對(duì)照，在190bp，保證PCR反應(yīng)的正常。