Vero 細胞無血清細胞培養(yǎng)基的發(fā)展

無血清細胞培養(yǎng)基的發(fā)明是培養(yǎng)基發(fā)展史的一個里程碑。無血清培養(yǎng)基是向基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加血清替代物，既滿足動物細胞的營養(yǎng)需求，又能有效避免使用血清而引發(fā)的一系列問題，為無血清培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展奠定了基礎(chǔ)。

20世紀80年代后期，具有商業(yè)價值的新型無血清培養(yǎng)基紛紛上市。無血清培養(yǎng)基的迅速發(fā)展和顯著優(yōu)勢，使得無血清培養(yǎng)基在動物細胞工程領(lǐng)域得到了重要的應(yīng)用。盡管牛血清( FBS) 作為細胞培養(yǎng)基的必需添加因子而廣泛使用，它提供細胞在體外培養(yǎng)貼附生長和增殖所必需的營養(yǎng)因子，但近幾年來對血清的生產(chǎn)使用存在道德和科學上的諸多爭議，并且牛血清的使用存在諸多缺點和風險。經(jīng)過研究者們的不懈努力，后來摸索出了一些降低或替代血清的策略，研發(fā)出了一系列低血清和無血清培養(yǎng)基供動物細胞和組織培養(yǎng)使用，盡可能避免血清的缺點和風險。

在20世紀50年代之前，在動物細胞培養(yǎng)過程中，用純牛血清來培養(yǎng)動物細胞。50 年代后期，逐漸出現(xiàn)了 RPMI、MEM 等簡單的培養(yǎng)基配方，并添加少量的牛血清就能完全滿足細胞培養(yǎng)的基本營養(yǎng)需求，因此將血清含量降到了20%。到70年代，各種基礎(chǔ)的細胞培養(yǎng)基紛紛上市并廣泛應(yīng)用，培養(yǎng)基中血清的添加含量降到更低，為5%～10% 。

Vander等[1]用激素替代牛血清刺激特定細胞分化生長的工作，開辟了化學界定無血清培養(yǎng)基的發(fā)展開端。大多數(shù)無血清培養(yǎng)基的配方設(shè)計都申請了**，秘而不宣，因此實際應(yīng)用中使用的是商業(yè)化的無血清培養(yǎng)基。

Vero 細胞 (非洲綠猴腎細胞) 是日本學者 Yasumura 和 Kawakita 兩人在 1962 年正式從非洲綠猴腎臟分離的，是世界衛(wèi)生組織(WHO) 和《中國藥典》認可的疫苗生產(chǎn)細胞系。使用血清培養(yǎng)宿主細胞較大的風險是向疫苗產(chǎn)品中引入血源性病原生物污染的潛在可能，從而影響疫苗的生產(chǎn)工藝和安全問題。

無血清化學限定培養(yǎng)基的設(shè)計和優(yōu)化是Vero細胞無血清培養(yǎng)技術(shù)的關(guān)鍵?，F(xiàn)今商業(yè)化的Vero細胞無血清的配方設(shè)計比較通用的方法是選定一種基礎(chǔ)培養(yǎng)基，Vero細胞可選用的培養(yǎng)基有M199、MEM、DMEM等合成培養(yǎng)基。近年來，HiMedia公司生產(chǎn)的SFRE 199系列頗受歡迎，它是在基礎(chǔ)培養(yǎng)基M199的基礎(chǔ)上改良的，開始用于原代狒狒腎細胞(Bak)的生長和維持。繼而國外很快將SFRE 199用于vero細胞的無血清培養(yǎng)，效果頗佳[2]。（下圖）。結(jié)果顯示，NCTC 135和SFRE 199-1培養(yǎng)基1：1混合懸浮培養(yǎng)Vero細胞，同時添加BSA1μg/mL和亞油酸0.1μg/mL，細胞數(shù)量快速增長，在第50天至70天時，細胞數(shù)量增加到107/ml并保持穩(wěn)定，而另一種培養(yǎng)基NCTC 135：Waymouth  MB 752/1的培養(yǎng)效果則較差。

NCTC 135培養(yǎng)基（貨號：AT227）和SFRE-199-1（AT089）HiMedia均有生產(chǎn)，為干粉包裝，有5L，10L，20L或更大規(guī)格可選。

SFRE 199對M199的改進主要表現(xiàn)在顯著提高了精氨酸-鹽酸、半胱氨酸、胱氨酸、L -谷氨酰胺、L -谷氨酸、甘氨酸、組氨酸、酪氨酸和葡萄糖的濃度，使細胞實現(xiàn)較大的無毒活性。同時添加了丙酮酸鈉、硫酸鋅、胰島素、半乳糖等。半乳糖可避免乳酸過度積累，并使pH值在細胞延長的維持期內(nèi)，保持在生理范圍。

SFRE 199分為1型和2型。SFRE 199-1含有Hank鹽，SFRE 199-2含有Earle's鹽，對CO2的耐受能力不同。二者均不含胰島素，胰島素需在使用前單獨添加。

參考文獻

[1] Vander VJ，Brunner D，De Smet K，et al． Optimization of chemically defined cell culture media-Replacing fetal bovine serum in mammalian in vitro methods[J]. Toxicology in Vitro，2010，24(4) : 1053-1063．

[2] Jack Litwin.The growth of Vero cells in suspension as cell-aggregates in serum-free media. State Bacteriology Laboratory, 105 21 Stockholm, Sweden.

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