探究分泌和攝取用于細胞間通訊的外泌體和其他胞外囊泡

盡管在20世紀60年代后期**描述了在哺乳動物組織或液體中，有囊泡在細胞周圍存在，但是直到2011年才提出通用術(shù)語“胞外囊泡（extracellular vesicle, EV）”來定義所有的由脂質(zhì)雙層包圍的胞外結(jié)構(gòu)，如圖1所示。在1980年代，人們描述了EV可以通過質(zhì)膜向外出芽或通過細胞內(nèi)內(nèi)吞運輸途徑形成，其中這種細胞內(nèi)內(nèi)吞運輸途徑涉及多泡晚期內(nèi)吞區(qū)室---也稱為多泡體（multivesicular body, MVB）---與質(zhì)膜的融合，如圖2所述。這種融合事件導致這些區(qū)室中的管腔內(nèi)囊泡（intraluminal vesicle, ILV）釋放到細胞外，從而產(chǎn)生一種稱為外泌體（exosome）的EV亞型，而且所產(chǎn)生的外泌體具有與ILV相同的大小（直徑<200nm）。

人們最初認為外泌體分泌是細胞清除不想要的蛋白的一種機制。然而，20世紀90年代后期的研究表明，它可以起到細胞間通訊的作用，特別是在免疫反應和癌癥中。對這一概念的強烈支持出現(xiàn)在2007年，在那年科學家們已證實外泌體含有mRNA和microRNA，而且當被轉(zhuǎn)移到受者細胞時，所含有的mRNA和microRNA仍然保持功能并改變細胞行為。與此同時，EV被稱為微泡（microvesicle），微粒（microparticle）或核外粒體（ectosome），很可能是從質(zhì)膜釋放出來的，而且也已經(jīng)證實能夠在細胞之間轉(zhuǎn)移功能性的蛋白和RNA。

人們已觀察到在各種細胞類型中，大小與外泌體一樣或更大的EV是從細胞主體的質(zhì)膜或膜延伸物（比如微絨毛、絲狀偽足，纖毛和鞭毛）出芽而形成的。大小與外泌體相當?shù)腅V在大小、密度和膜定位方面具有與外泌體相同的生物物理特征，因此，目前的方法無法有效地將它們區(qū)分開來。

細胞釋放出的源自MVB的外泌體與其他小型EV的相對比例是高度可變的，取決于細胞類型、環(huán)境條件和其他因素（比如感染或人工誘導分子表達），而且通過當前的大多數(shù)實驗方法制備出的外泌體可能含有內(nèi)體起源的小型EV（也就是外泌體）和非內(nèi)體起源的小型EV，以及其他的基于脂質(zhì)的非囊泡結(jié)構(gòu)（比如多種密度的脂蛋白，即中密度脂蛋白、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白和極低密度脂蛋白）和新鑒定出的外泌顆粒（exomere）。近期，富含晚期內(nèi)體組分的外泌體被定義為一種帶有四跨膜蛋白CD63（一種在MVB中堆積的蛋白）和CD9/CD81（主要存在于質(zhì)膜上）的小型EV亞型，不過這種定義還需其他的細胞和條件下進行驗證。在包括癌癥、免疫反應、心血管疾病、再生和干細胞療法在內(nèi)的許多病理生理情況下，EV發(fā)揮著許多功能。盡管許多研究將這些功能描述為是外泌體特有的，但是人們已發(fā)現(xiàn)許多外泌體制備物存在潛在的多種亞細胞起源，這表明多種EV類型具有更廣泛的功能相關性。

在一篇新的發(fā)表在2019年1月那期Nature Cell Biology期刊上的評論類型文章中，Mathilde Mathieu等人通過一些非詳盡的例子討論了外泌體和源自質(zhì)膜的EV在生物發(fā)生、分泌、將它們的內(nèi)含物靶向運送到受者細胞中和隨后在受者細胞中發(fā)揮的功能方面的特異性[1]。

1.在MVB內(nèi)部或質(zhì)膜上的囊泡出芽

內(nèi)體ILV和源自質(zhì)膜的EV共有的一個重要特征是與在不同區(qū)室之間進行運送所需的其他細胞內(nèi)出芽事件不同的是，它們朝著遠離細胞質(zhì)的方向進行出芽。因此，它們的膜定位與細胞表面的膜定位相同，從而暴露跨膜蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域并包圍細胞質(zhì)組分。鑒于已知的EV生物發(fā)生、分泌以及與靶細胞之間相互作用的分子機制已在其他地方進行了全面綜述[2]，在這篇新的評論類型文章中，Mathilde Mathieu等人描述了在MVB內(nèi)部囊泡（即未來的外泌體）形成的關鍵實例，以及這些機制是否以及如何以及如何適用于在質(zhì)膜上形成的EV（圖2）。 （1）ESCRT。轉(zhuǎn)運所需的內(nèi)體分選復合物（ESCRT）是一個蛋白家族，它們在MVB膜上與一系列復合物（ESCRT-0，ESCRT-I，ESCRT-II和ESCRT-III）結(jié)合以便調(diào)節(jié)分子貨物靶向運送到ILV中和ILV形成。在小型EV制備物種存在的TSG101（tumour susceptibility gene 101 protein）和其他的ESCRT蛋白或ESCRT輔助分子，比如ALIX（由PDCD6IP編碼）和VPS4（vacuolar protein sorting-associated protein 4），經(jīng)常被視為它們起源自MVB的證據(jù)。然而，ESCRT因子參與質(zhì)膜上的各種出芽和膜斷裂事件，所有這些事件都需要ESCRT-I/II/III和輔助分子，從而導致EV釋放。

ESCRT-0組分通常未在質(zhì)膜出芽和釋放模型中描述過。因此，EV分泌的ESCRT-0依賴性可能是證明它們起源自MVB的手段。因此，剔除HeLa細胞中的ESCRT-0組分HRS（由HGS編碼）或STAM1（signal transducing adapter molecule 1）會減少攜帶CD63和MHC-II/CD81的小型EV（對應于外泌體）的分泌。然而，這些方法可能會引起不相關但容易混淆的影響。比如，在HIV病毒感染期間的HRS剔除通過阻止通常在質(zhì)膜上截留病毒顆粒的tetherin（由BST2編碼）降解而減少了從質(zhì)膜上釋放的病毒。鑒于tetherin也將源自MVB的外泌體保留在質(zhì)膜片（plasma membrane patch）上，這可能還減少外泌體和源自質(zhì)膜的EV的分泌。HRS結(jié)合到蛋白的泛素部分上，從而將蛋白靶向運送到ILV中。

然而，在小型EV中存在的泛素化蛋白并不能支持它們的外泌體性質(zhì)，這是因為來自質(zhì)膜來源的EV的泛素化蛋白的缺乏尚未得到證實。相反，在細胞接觸1型干擾素后，蛋白隨后與泛素樣分子ISG15的結(jié)合經(jīng)證實觸發(fā)MVB-溶酶體融合，從而減少外泌體分泌。然而，鑒于一個至為重要的ISG15靶標是TSG101，而TSG101也是質(zhì)膜來源的小型EV形成所所必需的，因此在增強的ISG15結(jié)合后觀察到的分泌體減少可能并不是外泌體所獨有的。

（2）脂質(zhì)。朝著遠離細胞質(zhì)的方向進行出芽的囊泡包括由鞘磷脂酶產(chǎn)生的錐形脂質(zhì)，如神經(jīng)酰胺。經(jīng)證實抑制中性鞘磷脂酶（nSMAse-2，由SMPD3編碼）通過一種不依賴于ESCRT的機制阻止MVB中的ILV出芽和外泌體釋放。雖然這篇新的文章并未探究它們對其他EV的影響，但是神經(jīng)酰胺抑制藥物（尤其是GW4869）或靶向nSMAse-2的RNA干擾通常用于證實所分析的EV的外泌體性質(zhì)，和/或一種特定功能依賴于外泌體的性質(zhì)。然而，影響神經(jīng)酰胺產(chǎn)生途徑會影響許多其他的細胞特性。具體而言，GW4869可通過一種不依賴于nSMAse的機制誘導稍大一些的質(zhì)膜來源的EV的補償性分泌或細胞死亡。此外，nSMAse控制著通用的后高爾基體轉(zhuǎn)運（post-Golgi trafficking），因而潛在地控制著所有分泌。神經(jīng)酰胺還調(diào)節(jié)可能間接影響MVB穩(wěn)態(tài)的自噬。一般而言，在解釋化合物或?qū)虮磉_進行調(diào)節(jié)對EV分泌的影響時，應考慮對細胞死亡和自噬的影響。

在秀麗隱桿線蟲中，磷脂酰乙醇胺的外部化導致EV出芽和釋放，其中磷脂酰乙醇胺通常通過翻轉(zhuǎn)酶（flippase）維持在質(zhì)膜的胞質(zhì)面上。在哺乳動物細胞中，磷脂酰絲氨酸和磷脂酰乙醇胺不對稱性的喪失也導致質(zhì)膜來源的囊泡出芽，并且兩個具有促翻轉(zhuǎn)酶（scramblase）活性的蛋白家族參與這個過程。然而，這些機制對外泌體分泌的影響尚未被探究過。

（3）多配體聚糖（syndecan）和多配體聚糖結(jié)合蛋白（syntenin）。將跨膜蛋白特異性地靶向MVB的ILV中也能夠通過蛋白-蛋白相互作用發(fā)生。多配體聚糖結(jié)合蛋白-1（syntenin-1，由SDCBP編碼）在與多配體聚糖-1（syndecan-1）的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域結(jié)合后，招募ALIX，接著與ESCRT-I-III組分一起，允許向內(nèi)出芽進入ILV中并隨后在含有外泌體的沉淀中回收多配體聚糖結(jié)合蛋白和多配體聚糖-1。這種機制依賴于Src介導的多配體聚糖-1內(nèi)吞作用，并且需要磷脂酶D2和ARF6（ADP-ribosylation factor 6, ADP-核糖基化因子6）的GTP酶活性。然而，該途徑可能不是所有細胞類型中MVB來源的外泌體特異性的。在樹突細胞和脂肪細胞中，多配體聚糖結(jié)合蛋白在小型EV（特別是對應于外泌體的那些EV）中最為豐富，但是也在較大的EV中檢測到。此外，ARF6也是腫瘤細胞釋放的大型EV形成所必需的。

（4）MVB酸化。沿著內(nèi)吞途徑的逐步酸化是內(nèi)化組分的降解和再循環(huán)所必需的。Atg5（Autophagy protein 5, 自噬蛋白5）和Atg16L1將V1-ATPase的E1亞基（由ATP6V1E1編碼）解離并因此清除它的質(zhì)子轉(zhuǎn)運蛋白活性，或者巴弗洛霉素（bafilomycin）處理，均可降低MVB酸化并顯示增加人細胞中的外泌體分泌。這表明pH值可能是MVB作為分泌區(qū)室（secretory compartment）還是降解區(qū)室（degradatory compartment）的決定因素。或者，增加的外泌體分泌可能是由于內(nèi)吞作用減少和由MVB功能發(fā)生改變的細胞分泌的外泌體降解，或者是由于巴弗洛霉素對高爾基體運輸?shù)拈g接影響。

雖然當前關于外泌體MVB中的生物發(fā)生的討論并不詳盡，但是需要考慮的一個關鍵點是在目前已知的生物發(fā)生機制中，沒有一種機制是完全特異于外泌體途徑的，或者在所有細胞類型中都是有效的。

2.外泌體和EV分泌的胞內(nèi)轉(zhuǎn)運

只要允許MVB轉(zhuǎn)運至質(zhì)膜并與質(zhì)膜融合的細胞內(nèi)轉(zhuǎn)運分子是外泌體分泌所特有的，那么它們也可允許區(qū)分外泌體與質(zhì)膜來源的EV。

（1）Rab GTP酶。Rab家族的小GTP酶成員在胞內(nèi)區(qū)室之間轉(zhuǎn)移囊泡方面發(fā)揮了良好的作用，并且還涉及MVB轉(zhuǎn)運到質(zhì)膜以便釋放外泌體。比如，破壞Rab27a或Rab27b會改變MVB形態(tài)并及其停靠在質(zhì)膜上，這表明它們在外泌體分泌中發(fā)揮作用。雖然這項研究和隨后的研究均未評估操縱Rab27a/b對其他EV分泌的影響，但是單獨抑制Rab27a會以一種依賴于MVB的方式降低HIV從質(zhì)膜中分泌出來。這一觀察結(jié)果是否也適用于非病毒誘導的質(zhì)膜來源的EV仍然是不清楚的，但是在理解Rab27抑制的EV相關影響時，這一點是值得考慮的。除了MVB之外，Rab27a/b參與Weibel-Palade 小體和高爾基體來源的分泌顆粒的分泌。因此，正如在剔除Rab27a的腫瘤細胞中對一些可溶性非EV相關蛋白所觀察到的那樣，Rab27a/b抑制可能影響存在于這些顆粒內(nèi)的可溶性組分的分泌。基于此，利用Rab27a/b抑制來證實外泌體或小型EV參與其中需要額外的步驟，比如通過外源性的外泌體或小型EV拯救表型。

同樣的考慮適用于促進外泌體或小型EV分泌的其他小GTP酶。比如，抑制Rab11a、Rab35或Rab7導致小型EV恢復減少。然而，Rab11和Rab35在早期內(nèi)體或再循環(huán)內(nèi)體中起作用，從而提高了釋放的囊泡來自早期內(nèi)體或甚至來自質(zhì)膜的可能性。有趣的是，在細胞毒性T細胞中，Rab27a+晚期內(nèi)體與Rab11a+再循環(huán)內(nèi)體之間的融合由Rab27a效應物Munc13-4（由UNC13D編碼）介導，并且是調(diào)節(jié)細胞毒性顆粒與質(zhì)膜之間的融合所必需的。類似地，Rab11a和Rab27a交談可能參與最近描述的外泌體在人癌細胞系中發(fā)生鈣離子誘導的Rab11a-Munc13-4依賴性的分泌。總之，這些研究表明細胞類型、環(huán)境和對處于穩(wěn)定狀態(tài)或誘導時的EV分泌進行的分析（比如，通過鈣離子水平增加或其他方式）可能影響小型EV和/或外泌體分泌的機制，因此一種具體的實驗條件可能并不適用于其他的實驗系統(tǒng)。

（2）SNARE。Rab GTPase可能在比較早的或復雜的細胞內(nèi)轉(zhuǎn)運步驟中起作用，從而用于調(diào)節(jié)外泌體分泌。因此，研究外泌體生物發(fā)生的一個主要目的是鑒定MVB與質(zhì)膜融合所特別需要的SNARE復合物。人們已發(fā)現(xiàn)YKT6 SNARE是攜帶Wnt的外泌體分泌所必需的，并且據(jù)報道Syx-5（秀麗隱桿線蟲中的一種與syntaxin-5存在同源關系的蛋白）通過Ral-1小GTP酶將MVB靶向質(zhì)膜。然而，鑒于這兩種SNARE都涉及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-高爾基體轉(zhuǎn)運，對它們的抑制也必然會影響正常的分泌途徑。

特別地，科學家們已發(fā)現(xiàn)作為一種神經(jīng)元特異性的參與突觸小泡分泌的SNARE，syntaxin-1A影響果蠅中的外泌體分泌。在HeLa細胞中，在組胺處理后，作為一種質(zhì)膜相關的SNARE，SNAP-23（synaptosomal-associated protein 23, 突觸體相關蛋白23）自發(fā)地介導MVB-質(zhì)膜融合。盡管這些SNARE參與更靠近質(zhì)膜的融合事件因而可能不會干擾上游轉(zhuǎn)運，但是它們也可能參與分泌顆粒的分泌。

在細胞水平上可視化觀察MVB運輸和EV釋放也可區(qū)分分泌途徑和降解途徑。比如，聯(lián)合使用pH敏感性的熒光CD63構(gòu)建體和光電關聯(lián)顯微鏡（correlative light-electron microscopy），允許對MVB與質(zhì)膜之間的融合進行明確的可視化觀察和定量分析。然而，該途徑與直接質(zhì)膜出芽或與較弱酸性的區(qū)室之間的融合的相應貢獻是無法確定的，這是因為后面的事件不能通過這種類型的pH敏感性的實驗系統(tǒng)來加以量化。

（3）細胞骨架。EV的出芽和釋放需要在質(zhì)膜下發(fā)生變化的肌動蛋白聚合以及隨后在由小GTP酶RhoA精心協(xié)調(diào)的過程中發(fā)生的肌動蛋白細胞骨架收縮。然而，人們尚未探究MVB周圍的肌動蛋白池（actin pool）的狀態(tài)及其對ILV形成的潛在影響。皮質(zhì)肌動蛋白的解聚也可能是允許MVB停靠在質(zhì)膜上以便外泌體的隨后釋放所必要的。

因此，靶向肌動蛋白聚合可間接地促進外泌體分泌。類似地，這種微管網(wǎng)絡很可能是將MVB轉(zhuǎn)運到質(zhì)膜上所必需的；然而，盡管對它進行藥物抑制會降低外泌體分泌，但是它也影響其他的質(zhì)膜來源的結(jié)構(gòu)域，比如纖毛或納米管。因此，盡管細胞骨架成分可能在分泌外泌體還是質(zhì)膜來源的EV中起重要作用，但是靶向它們也可能誘導多種非特異性的作用。

3.包膜病毒與外泌體和其他的小型EV相比較

包膜病毒出芽與小型EV的生物發(fā)生有許多相似之處。病毒在病毒顆粒組裝和出芽的不同步驟中使用宿主細胞內(nèi)運輸機制，而對EV而言，這些步驟可能根據(jù)病毒和宿主細胞的不同在不同位置發(fā)生。在HIV-1中，病毒組裝發(fā)生在T細胞的質(zhì)膜上，而在巨噬細胞中，它發(fā)生在內(nèi)部區(qū)室中。在膜出芽部位招募HIV-1 Gag蛋白對于病毒組分的最終組裝是必需的。Gag還會招募ESCRT復合物，包括TSG101和ALIX，它們最終通過膜裂變事件介導新生顆粒的釋放。Gag的核衣殼結(jié)構(gòu)域能夠模擬多配體聚糖結(jié)合蛋白的PDZ結(jié)構(gòu)域來捕獲ALIX，這就使得多配體聚糖結(jié)合蛋白能夠在HIV-1出芽期間替代核衣殼功能。

與大型EV和含有多配體聚糖結(jié)合蛋白的外泌體相比，HIV-1出芽并不依賴于ARF6 GTP酶，但它還涉及許多已知也促進EV分泌的Rab蛋白，包括Rab9、Rab7a、Rab27a、Rab14和Rab11-FIP1C。Rab14是個例外，它在EV調(diào)節(jié)中的潛在作用仍有待研究。SNARE也參與HIV和EV釋放。對SNARE機制的抑制證實它在Gag蛋白定位到質(zhì)膜上發(fā)揮作用，因此，也在HIV-1裝配中發(fā)揮作用；然而，尚未確定的是一些SNARE是否是EV特有的而不影響HIV。最后，HIV-1組裝涉及絲狀肌動蛋白結(jié)構(gòu)的形成，這種結(jié)構(gòu)會在病毒出芽后消失。雖然干擾肌動蛋白的藥物會減少病毒產(chǎn)生，但是如前所述，它們也可能影響EV的釋放。由于這些過程的許多方面仍然在很大程度上是未知的，因此有必要鑒定和描述調(diào)節(jié)EV和病毒產(chǎn)生的特定步驟的各個分子。

HIV-1病毒的直徑大約為120nm，與外泌體和小型EV的直徑相當。這些膜包圍結(jié)構(gòu)還具有其他的物理和分子特征。比如，HIV-1病毒顆粒和小型EV的脂質(zhì)組合物包括高比例的膽固醇、鞘磷脂和飽和脂質(zhì)，并且它們都具有相同的膜定位。HIV-1病毒顆粒膜也富含CD63和CD81四跨膜蛋白，其中這兩種四跨膜蛋白存在于小型EV上。這些相似性使得將病毒顆粒和EV與受到病毒感染的細胞分離開來特別具有挑戰(zhàn)性。比如，小型EV和HIV-1病毒顆粒在蔗糖密度梯度中達到相同的平衡密度。更為復雜的是，受到病毒感染的細胞產(chǎn)生經(jīng)過修飾的整合著病毒基因組片段和病毒蛋白的EV，這意味著經(jīng)典的純化技術(shù)導致這些組分共純化。因此，在HIV-1感染期間對小型EV功能的研究受到難以獲得不含HIV的EV制備物的阻礙，這可能解釋存在相互矛盾的關于誘導前病毒EV反應和抗病毒EV反應的報道。

4.EV攝取的生物學機制及其發(fā)揮的功能的例子

對EV興趣的增加與它們引發(fā)受者細胞表型變化的能力有關。EV尺寸和/或表面組分的差異很可能影響靶細胞對它們的識別和捕獲。比如，微胞飲（micropinocytosis）在理論上能夠捕獲分離的外泌體和小型EV，但是不能捕獲太大的EV或小型EV聚集體。鑒于人們才開始意識到EV的多樣性，因此在它們到達受者細胞后，人們對不同EV亞型的命運的了解仍然有限。因此，在這篇評論性文章的這一部分，Mathilde Mathieu等人將討論一般的EV攝取機制及其相關功能。

EV能夠通過在細胞表面起作用而將信息傳遞給受者細胞，而不用傳送它們的內(nèi)含物。比如，在免疫反應期間，攜帶MHC-肽復合物的EV可激活T細胞上的同源T細胞受體。EV也能夠被內(nèi)化，隨后要么靶向到溶酶體中用于降解，要么進入再循環(huán)并釋放到胞外空間。在受者乳腺癌細胞內(nèi)的這種類型的EV再循環(huán)使得Wnt11與內(nèi)化的來源自成纖維細胞的CD81+ EV相結(jié)合。這表明這些顆粒的再釋放通過Wnt相關的信號轉(zhuǎn)導觸發(fā)乳腺癌細胞遷移。

然而，EV的主要特征是包圍和傳送受到脂質(zhì)雙層保護的分子。許多研究報道了EV分子貨物全部運送的影響。下面將通過選定的例子說明這一點。一些報道證實EV在腫瘤進展中發(fā)揮作用，比如，通過交換膠質(zhì)母細胞瘤細胞和內(nèi)皮細胞之間的RNA，和交換成神經(jīng)管細胞瘤細胞和內(nèi)皮細胞之間的致癌DNA序列和反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子元件，以及交換膠質(zhì)瘤細胞之間的蛋白，如致癌性的表皮生長因子受體變體III（EGFRvIII）。在神經(jīng)系統(tǒng)中也報道了蛋白的轉(zhuǎn)移，在那里，EV介導的胞質(zhì)突觸結(jié)合蛋白4（cytosolic synaptotagmin 4）從突觸前細胞轉(zhuǎn)移到突觸后細胞，從而允許逆向控制突觸前活動。在另一種情形下，將有毒成分（比如朊病毒的瘙癢病形式，即PrPsc）裝載到EV中，從而擴散到正常細胞中。此外，HIV-1傳播和增殖所需的趨化因子受體CCR5可通過EV在單核細胞和內(nèi)皮細胞之間進行交換，從而導致通常不具備病毒感染所需的這種受體的組織遭受感染。攝取EV和將它的分子貨物運送到受者細胞的細胞質(zhì)中的機制仍未完全得到描述，如圖3所示。

EV攝取的**步涉及靶向受者細胞。然而，EV亞型和受體細胞的特定組合是否賦予靶向特異性或該過程是否是非特異性還是隨機性的仍然未得到解決，而且現(xiàn)有文獻對這兩種可能性都提供了支持。比如，由少突膠質(zhì)細胞分泌的小型EV優(yōu)先內(nèi)化到小膠質(zhì)細胞而不是神經(jīng)元中。來自原代神經(jīng)元的小型EV僅被其他的神經(jīng)元捕獲，然而來自神經(jīng)母細胞瘤細胞系的小型EV同樣地結(jié)合星形膠質(zhì)細胞。相比之下，正如針對經(jīng)過親脂性染料或熒光性的CD63廣泛標記的EV開展的實驗所證實的那樣，HeLa細胞能夠攝取由不同細胞產(chǎn)生的各種EV，而且這似乎適用于各種細胞類型。為一種通用的靶向過程提供進一步支持的是，EV介導的分子貨物轉(zhuǎn)移能夠在物種間環(huán)境（小鼠和人類）發(fā)生。然而，至于組合使用EV和細胞類型是否可能實現(xiàn)生理學相關的特異性靶向，這仍然有待闡明。CD47是一種保護細胞免受吞噬作用的整合素相關蛋白，通常在EV的表面上發(fā)現(xiàn)，并且通過阻止巨噬細胞和單核細胞的吞噬作用，增加EV在血液中的循環(huán)時間。這導致這些EV更有效地靶向胰腺細胞以便運送人工裝載的短干擾RNA（siRNA），這表明細胞靶向也可能通過一種陰性選擇機制得以實現(xiàn)。鑒定EV的生理靶標以及這些靶標對于特定EV亞型如何可能存在不同將在選擇實驗模型和開發(fā)新的測定方法方面提供巨大優(yōu)勢。

EV攝取的第二步是進入受體細胞的入口點。雖然大多數(shù)研究報道了受者細胞對EV的內(nèi)化，但是這是通過一種非特異性過程（比如巨胞飲或微胞飲），還是通過一種特定的受體依賴性途徑發(fā)生，仍然是不清楚的。定位于EV和受者細胞表面的許多蛋白，包括整合素、凝集素/蛋白聚糖、T細胞免疫球蛋白和Tim4（mucin domain-containing protein 4, 含有粘蛋白結(jié)構(gòu)域的蛋白4）已被提出參與EV攝取，因此它們也可能導致細胞靶向特異性。然而，沒有一種蛋白是通過證實它是EV內(nèi)化所充分必要的而被確定為真正的EV受體。許多EV亞型具有相同的表面蛋白，并且它們中的一種蛋白可能充當受體的一般配體，從而使得囊泡得以內(nèi)化，這類似于低密度脂蛋白的攝取機制。

到目前為止，據(jù)報道EV內(nèi)化通過多種途徑發(fā)生，這些途徑涉及網(wǎng)格蛋白依賴性途徑和網(wǎng)格蛋白非依賴性途徑的內(nèi)吞作用。人們對EV功能的這一方面也缺乏共識。比如，科學家們已提出參與網(wǎng)格蛋白非依賴性內(nèi)吞作用的小窩蛋白1（caveolin 1）在相對相似的實驗裝置中對EV攝取具有負面影響和正面影響。這種攝取途徑可能更依賴于受者細胞類型而不是EV本身，這是因為在大多數(shù)研究中，EV通過使用通用親脂性染料被廣泛追蹤。

EV攝取的第三步也是最后一步是將它的內(nèi)含物運送到受者細胞中。許多研究沒有評估EV內(nèi)化的終點（比如，是內(nèi)含物運送，還是EV降解或再分泌），這阻礙了針對EV介導的分子貨物轉(zhuǎn)移的功能性后果作出結(jié)論。然而，人們已提出質(zhì)膜作為通過膜融合運送內(nèi)含物的靶膜。對質(zhì)膜來源的能夠運送DNA的EV而言，可能就是這種情形，這是因為它們較大的尺寸可能限制了它們的內(nèi)化。盡管這種機制不能夠正式地加以排除，但是大多數(shù)出版物都報道在運送分子貨物之前，EV通過內(nèi)化進入細胞中。因此，人們猜測內(nèi)體是運送EV內(nèi)含物的位置，作為對酸性pH作出的反應，膜融合已被提出是一種潛在的機制，這類似于一些病毒所使用的這個過程。脂質(zhì)，比如膽固醇和磷脂酰絲氨酸，可能也在膜融合中發(fā)揮作用。比如，已有報道指出膜聯(lián)蛋白V（annexin V）結(jié)合暴露于某些EV表面上的磷脂酰絲氨酸，阻斷來源自單核細胞的EV和活化的血小板之間的融合。然而，許多EV在它們的表面上并不含有磷脂酰絲氨酸，這表明其他分子參與其中。EV拓撲結(jié)構(gòu)表明它們與質(zhì)膜或內(nèi)體膜之間的融合將需要一種不同于用于胞內(nèi)囊泡之間融合的SNARE蛋白的特定機制。可能控制EV從內(nèi)體中逃逸出去的其他機制也不能夠加以排除，比如通過釋放來自破裂的內(nèi)體或溶酶體區(qū)室的受到部分降解的材料。此外，人們已描述了一些意想不到的運送機制，包括通過這些區(qū)室與含有內(nèi)化EV的內(nèi)體的接觸直接轉(zhuǎn)移到細胞核或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中。這些觀察結(jié)果等待進一步研究，但提出了關于EV特異性胞內(nèi)命運的有趣可能性。

5.結(jié)論

過去十年的一個重大進步是人們越來越認識到EV包括許多不同的顆粒亞型，而且每種顆粒亞型在細胞間通信中都可能具有有趣的功能。盡管人們對這一領域的興趣日益濃厚，但對控制EV生物發(fā)生、釋放、攝取和功能的細胞和分子機制的理解仍然是有限的。精確描述EV的一個關鍵限制是分離和描述純的特定顆粒亞型存在技術(shù)難度，這是因為人們當前所使用的方法導致對不同亞細胞來源的EV進行系統(tǒng)性共分離。因此，盡管許多文章使用術(shù)語“外泌體”來指代通過物理過程與較大的EV分離開來的EV制備物，但它們很可能是指外泌體性質(zhì)和非外泌體性質(zhì)的小型EV的混合物。因此，除非明確確定它們的MVB來源，不然可能**支持通用術(shù)語“小型EV”。

人們當前對EV生理學、多樣性、內(nèi)化和分子貨物運送的了解仍然非常有限，因而無法準確地得出關于EV如何與受者細胞相互作用并對它們進行修飾的機制得出結(jié)論。為了讓EV領域取得進展，有必要以綜合的方式進行研究，包括分子、細胞和功能表征，從而盡可能地比較一種給定實驗系統(tǒng)中的不同EV亞型。這些方法對于確定哪些分子或機制對某些EV亞型是特異性的，哪些是適用于所有EV亞型的至關重要。

一個受益于進一步研究的特定領域是EV攝取。目前針對EV或一種給定的EV亞型將內(nèi)含物運送到受者細胞的細胞質(zhì)中的主要途徑，還沒有達成共識。確定內(nèi)化是否通過巨胞飲或微胞飲和/或受體介導的途徑進行發(fā)生，以及這些過程是否導分子致貨物運送對于理解和控制EV攝取是至關重要的。一種合適的方法可能是首先跟蹤存在于許多不同EV類型中存在的通用可溶性分子貨物，以便確定分子貨物交換具有顯著的生理和生化作用的條件（包括供者細胞和受者細胞組合）。這些知識將允許描述EV攝取和內(nèi)含物運送的細胞和分子基礎。考慮各種生物發(fā)生、釋放和攝取途徑如何影響與EV無關的胞內(nèi)功能也很重要。這樣的系統(tǒng)性分析將有助于在生理和病理環(huán)境中鑒定特定EV功能，并且將有助于將這些知識轉(zhuǎn)化為對EV病理效應的治療或EV相關細胞機制在治療上的應用。