經(jīng)過(guò)CRISPR編輯的B細(xì)胞產(chǎn)生抗體，對(duì)抗難以治療的病毒

疫苗每年可以預(yù)防數(shù)百萬(wàn)人死亡，并將某些疾病推向了生存的邊緣。然而，事實(shí)證明，開(kāi)發(fā)針對(duì)多種病毒的有效疫苗即使不是不可能，也具有極大的挑戰(zhàn)性。

盡管進(jìn)行了數(shù)十年的研究，但尚未有得到批準(zhǔn)的疫苗能夠長(zhǎng)期預(yù)防流感病毒、愛(ài)潑斯坦巴爾病毒（EBV）或呼吸道合胞病毒（RSV）。比如，對(duì)作為一種引起呼吸道感染的病原體的RSV而言，高風(fēng)險(xiǎn)嬰兒每月接受合成抗體注射，以便在短期內(nèi)保護(hù)這些嬰兒。

近年來(lái)，幾組研究人員探索了一種不同的方法：利用免疫系統(tǒng)自身產(chǎn)生抗體的B細(xì)胞，并利用CRISPR對(duì)它們進(jìn)行改造，以便在感染的情況下按要求大量表達(dá)針對(duì)這些難以治療的病毒的抗體。

在一項(xiàng)新的研究中，來(lái)自美國(guó)弗雷德哈欽森癌癥研究中心和華盛頓大學(xué)的研究人員通過(guò)這樣做，成功地對(duì)人類和小鼠B細(xì)胞進(jìn)行基因修飾來(lái)表達(dá)靶向HIV、EBV、流感病毒和RSV的抗體。他們還證實(shí)這些經(jīng)過(guò)基因改造的B細(xì)胞在小鼠感染模型中阻止RSV感染。相關(guān)研究結(jié)果發(fā)表在2019年5月17日的Science Immunology期刊上，論文標(biāo)題為“B cells engineered to express pathogen-specific antibodies protect against infection”。

美國(guó)明尼蘇達(dá)大學(xué)基因組工程師Branden Moriarity（未參與這項(xiàng)新的研究）說(shuō)道，“這是一項(xiàng)非常好的研究。這是人們長(zhǎng)期以來(lái)一直在思考的概念。”

為了對(duì)B細(xì)胞進(jìn)行修飾，弗雷德哈欽森癌癥研究中心免疫學(xué)家Justin Taylor和他的團(tuán)隊(duì)探究了在之前研究中經(jīng)證實(shí)有效對(duì)抗這四種病毒中的每一種的抗體。他們使用一種常規(guī)的CRISPR策略將編碼抗體的DNA插入到在原代人B細(xì)胞的抗體編碼基因上產(chǎn)生的小切口中。

這些研究人員設(shè)計(jì)了這種插入，使得新抗體蛋白的表達(dá)受到這些細(xì)胞自身啟動(dòng)子的調(diào)節(jié)，從而允許這些細(xì)胞能夠像正常那樣在經(jīng)受病毒抗原觸發(fā)后產(chǎn)生它們。他們將盡可能多地讓這些經(jīng)過(guò)修飾的B細(xì)胞分化為分泌抗體的血漿B細(xì)胞，這些血漿B細(xì)胞在它們的細(xì)胞表面上表達(dá)這些抗體并分泌它們。

一旦這些研究人員證實(shí)這些經(jīng)過(guò)修飾的B細(xì)胞中的一個(gè)合理比例確實(shí)表達(dá)這些新抗體，他們就會(huì)研究這些細(xì)胞是否在小鼠中抵抗病毒感染。他們?cè)谛∈驜細(xì)胞中重復(fù)了這個(gè)過(guò)程，誘導(dǎo)它們表達(dá)靶向RSV的抗體，將成功修飾的B細(xì)胞群體灌注到正常的嚙齒動(dòng)物中，然后等待一段時(shí)間。

六天后，RSV特異性抗體出現(xiàn)在它們的血清中，但沒(méi)有出現(xiàn)在對(duì)照小鼠中。這些小鼠中的一些動(dòng)物接受鼻內(nèi)劑量的RSV注射，這些經(jīng)過(guò)修飾的B細(xì)胞成功地抵抗這種病毒。五天之后，這些研究人員幾乎沒(méi)有在血液中含有這些經(jīng)過(guò)修飾的B細(xì)胞的小鼠肺部中檢測(cè)到任何水平的RSV，但是他們?cè)诓缓羞@些B細(xì)胞的對(duì)照小鼠中發(fā)現(xiàn)了高水平的這種病毒。

Taylor說(shuō)，他認(rèn)為這些經(jīng)過(guò)修飾的B細(xì)胞可能對(duì)經(jīng)歷過(guò)造血干細(xì)胞移植的患者有用。這些患者通常服用了免疫抑制劑，非常容易受到病毒感染。這些患者遭受的RSV感染能夠通過(guò)諸接受如帕利珠單抗之類的合成抗體注射來(lái)阻止，但是必須定期接受這種注射。另一方面，經(jīng)過(guò)改造的B細(xì)胞理論上僅需注射一次。

為了研究經(jīng)過(guò)改造的B細(xì)胞是否可能在這種情況下提供保護(hù)，這些研究人員研究了缺乏T細(xì)胞和B細(xì)胞的突變小鼠。在他們將這些細(xì)胞注入到這些突變小鼠中后，他們吃驚地發(fā)現(xiàn)與野生型小鼠相比，這些突變小鼠中的RSV特異性抗體似乎在血液中停留更長(zhǎng)時(shí)間。事實(shí)上，免疫缺陷小鼠在接受這些經(jīng)過(guò)改造的B細(xì)胞移植82天后就能夠預(yù)防RSV感染。Taylor解釋道，為何會(huì)這樣是“我們需要更多探索的東西”。

總的來(lái)說(shuō)，Taylor團(tuán)隊(duì)采用的方法類似于近期其他研究所采用的方法，比如發(fā)表在eLife期刊上的一項(xiàng)研究（eLife, 2019, doi:10.7554/eLife.42995）和發(fā)表在Journal of Experimental Medicine期刊上的一項(xiàng)研究（Journal of Experimental Medicine, 2019, doi:10.1084/jem.20190287），這兩者都使用CRISPR來(lái)構(gòu)建表達(dá)HIV中和抗體的B細(xì)胞。但是不同之處在于，當(dāng)前的這項(xiàng)新的研究解決了對(duì)抗體編碼基因進(jìn)行改造的過(guò)程中的一些關(guān)鍵難題。

這是件棘手的事情：首先，抗體是由兩個(gè)基因合成的---一個(gè)基因用于編碼抗體的重鏈，一個(gè)基因用于編碼抗體的輕鏈。一旦重鏈和輕鏈分別翻譯成蛋白，它們就會(huì)融合在一起形成最終的抗體。對(duì)這些基因進(jìn)行編輯所面臨的挑戰(zhàn)在于錯(cuò)配有時(shí)可能會(huì)發(fā)生，從而導(dǎo)致由經(jīng)過(guò)改造的重鏈與B細(xì)胞自身的輕鏈配對(duì)在一起組成的雜合抗體。在某些情況下，這可能會(huì)導(dǎo)致自身免疫反應(yīng)。Taylor解釋道，“這種風(fēng)險(xiǎn)很低. . .但是，鑒于幾百萬(wàn)個(gè)B細(xì)胞有數(shù)百萬(wàn)個(gè)獨(dú)特的輕鏈，這個(gè)風(fēng)險(xiǎn)不值得冒。”

Taylor團(tuán)隊(duì)通過(guò)將編碼重鏈和輕鏈的DNA在物理上連接在一起并將連接后的DNA插入到單個(gè)CRISPR切割位點(diǎn)中來(lái)解決這個(gè)問(wèn)題。（其他的研究小組已設(shè)計(jì)出不同的策略來(lái)解決這個(gè)問(wèn)題，比如，敲除B細(xì)胞自身的輕鏈編碼基因。）

美國(guó)西雅圖兒童研究所免疫學(xué)家Richard James（未參與這項(xiàng)新的研究）評(píng)論道，“我認(rèn)為他們用來(lái)將輕鏈和重鏈融合在一起的基因改造策略是一個(gè)很好的想法，這很不錯(cuò)。”

然而，他補(bǔ)充道，“在實(shí)踐中，這將是一種昂貴的療法”，并指出個(gè)性化的CAR-T細(xì)胞療法已被認(rèn)為花費(fèi)接近50萬(wàn)美元。就目前而言，B細(xì)胞療法必須是個(gè)性化的：鑒于這些細(xì)胞表達(dá)個(gè)體特異性的細(xì)胞表面抗原，來(lái)自一個(gè)供者的細(xì)胞在不同的受者中會(huì)遭受免疫排斥。他補(bǔ)充道，“除非我們能找到構(gòu)建同種異體B細(xì)胞的方法，只有這樣才會(huì)變得更具成本效益。”

Moriarity同意這一點(diǎn)。他說(shuō)，“只有當(dāng)你患者一種你將死于的疾病而且真地沒(méi)有其他的治療方法時(shí)”，預(yù)防性地使用經(jīng)過(guò)改造的B細(xì)胞可能只是一種可行的治療選擇。不過(guò)，他說(shuō)，這項(xiàng)新的研究為未來(lái)的研究提供了其他的可能性，而且也是最早在小鼠B細(xì)胞中對(duì)抗體進(jìn)行改造的研究之一。對(duì)于研究B細(xì)胞分化和細(xì)胞與免疫相關(guān)過(guò)程的科學(xué)家來(lái)說(shuō)，“我認(rèn)為這將對(duì)基礎(chǔ)生物學(xué)領(lǐng)域做出巨大貢獻(xiàn)”。

曾是哈佛大學(xué)免疫工程師如今是免疫治療創(chuàng)業(yè)公司STIMIT首席執(zhí)行官的Michael Goldberg認(rèn)為這項(xiàng)新的研究是“之前研究的一個(gè)很好的延伸”。對(duì)他來(lái)說(shuō)，B細(xì)胞抗體改造除了能預(yù)防病毒感染外，還具有其他優(yōu)勢(shì)：比如，具有對(duì)血液中抗原濃度作出反應(yīng)的抗體水平可能可用于治療諸如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎之類的疾病，其中類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎通常用中和細(xì)胞因子TNFα的抗體加以治療。

然而，“抗體表達(dá)的持續(xù)時(shí)間需要增加。在這方面，加強(qiáng)我們對(duì)移植過(guò)程和B細(xì)胞培養(yǎng)條件的理解將是重要的。盡管如此，鑒于這些是**批涉及對(duì)經(jīng)過(guò)改造的B細(xì)胞進(jìn)行過(guò)繼性轉(zhuǎn)移的實(shí)驗(yàn)，初步結(jié)果令人鼓舞。”

Taylor同意仍有更多的研究工作需要開(kāi)展。他說(shuō)，“我們?cè)谶@項(xiàng)研究中完全忽略的一件事是真正評(píng)估我們正在做的事情的安全性，確保沒(méi)有任何脫靶效應(yīng)發(fā)生，我認(rèn)為這一直是人們針對(duì)CRISPR-Cas9所關(guān)心的一個(gè)問(wèn)題。在用于人體治療之前，我們必須絕對(duì)確定它是安全的。”