科學(xué)家發(fā)明簡(jiǎn)單高效地將綠色熒光蛋白探針紅移的技術(shù)

基于熒光蛋白的生物探針是目前揭示生物體內(nèi)離子和小分子濃度，以及生物信號(hào)網(wǎng)絡(luò)的強(qiáng)有力工具。盡管近些年科學(xué)家陸續(xù)進(jìn)化出個(gè)別基于紅色熒光蛋白的生物探針，大部分現(xiàn)有的生物探針依然只能發(fā)出綠色或者黃色熒光。由于黃綠色熒光蛋白激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)過(guò)于靠近，很難實(shí)現(xiàn)雙通道熒光監(jiān)測(cè)。

此外，紅色熒光蛋白生物探針相比綠色熒光探針具有較弱的光毒性，更弱的背景熒光以及高光透性等優(yōu)點(diǎn)。然而，由于紅色熒光探針熒光變化小，在細(xì)胞內(nèi)易聚集，以及存在光轉(zhuǎn)化等問(wèn)題，現(xiàn)有的紅色熒光探針普遍在功能上不如其對(duì)應(yīng)的綠色熒光版本。因此開發(fā)功能上更好的紅色熒光探針成為熒光顯影學(xué)界的研究重點(diǎn)。

相比傳統(tǒng)的定向進(jìn)化手段，遺傳密碼子擴(kuò)展技術(shù)是將蛋白質(zhì)定向進(jìn)化的一種有效工具。該技術(shù)能夠?qū)⒎翘烊话被岫c(diǎn)插入到目標(biāo)蛋白中，繼而改變目標(biāo)蛋白原有的理化性質(zhì)。

北京時(shí)間2020年9月14日晚23時(shí)，美國(guó)弗吉尼亞大學(xué) （University of Virginia）艾輝旺 （Hui-wang Ai）課題組在Nature Chemical Biology雜志上發(fā)表了題為“A general strategy to red-shift green fluorescent protein based biosensors”的文章，他們將3-氨基酪氨酸（3-amino tyrosine，aY）插入到綠色，黃色，青色熒光蛋白的發(fā)色團(tuán)酪氨酸殘基位置，將原本的熒光發(fā)射光紅移近100納米。該課題組進(jìn)一步將這項(xiàng)技術(shù)應(yīng)用于多種黃，綠色熒光蛋白生物傳感器中，使其熒光發(fā)射光紅移以減少其光毒性并實(shí)現(xiàn)了多熒光通道多檢測(cè)物的同時(shí)監(jiān)測(cè)。**作者為美國(guó)弗吉尼亞大學(xué)醫(yī)學(xué)院的張駪博士后，通訊作者為美國(guó)弗吉尼亞大學(xué)醫(yī)學(xué)院艾輝旺 （Hui-wang Ai）教授。

在該文中，該技術(shù)被應(yīng)用于成功改造5個(gè)不同的熒光蛋白和9個(gè)熒光生物探針。相比原有的綠色熒光版本，改造后的紅色熒光探針紅移近100納米。同時(shí)在蛋白，細(xì)胞系以及神經(jīng)元中證明了新進(jìn)化的紅色熒光探針保留了對(duì)應(yīng)原有的綠色熒光探針的動(dòng)態(tài)范圍，熒光強(qiáng)度，以及靈敏度。

該研究構(gòu)建了在大腸桿菌，哺乳動(dòng)物細(xì)胞系，以及神經(jīng)元中定向插入aY的技術(shù)，用以實(shí)現(xiàn)生物傳感器綠色熒光到紅色熒光到轉(zhuǎn)化。該技術(shù)不需要特殊的實(shí)驗(yàn)條件，并且通用于各種黃，綠色熒光蛋白及生物探針。綜上所述，本文發(fā)明了快速，簡(jiǎn)單，高效地進(jìn)化紅色熒光探針的方法。

這一研究進(jìn)一步將生物傳感器用于胰腺β細(xì)胞中代謝動(dòng)力學(xué)的多重成像。如預(yù)期的那樣，研究者觀察到了對(duì)高葡萄糖反應(yīng)的細(xì)胞ATP和鈣離子的增加。但是，NAD+/ NADH和NADPH的變化更為復(fù)雜。

胰腺β細(xì)胞在葡萄糖刺激后出現(xiàn)了持續(xù)幾分鐘的意外瞬態(tài)：高葡萄糖誘導(dǎo)了NADH以及NADPH的瞬時(shí)降低。這些現(xiàn)象很難用現(xiàn)有的β細(xì)胞糖誘導(dǎo)的胰島素釋放的刺激-分泌耦聯(lián)機(jī)制來(lái)解釋，需要進(jìn)一步的研究來(lái)闡明。