細(xì)胞培養(yǎng)中的污染監(jiān)控與檢測(cè)——支原體

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三、支原體污染

支原體概述：

支原體（mycoplasma）是一類沒(méi)有細(xì)胞壁、高度多形性、能通過(guò)濾菌器、可用人工培養(yǎng)基培養(yǎng)增殖的最小原核細(xì)胞型微生物，大小為0.1～0.3微米。由于能形成絲狀與分枝形狀，故稱為支原體。

在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，顯微鏡很難捕捉到它們的身影，與細(xì)胞競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)，影響細(xì)胞生長(zhǎng)，最終導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)出現(xiàn)偏差。

支原體污染癥狀：

在往期文章中，有介紹過(guò)如何鑒定支原體污染的，戳戳下方鏈接一起回顧

DIY判斷細(xì)胞的支原體污染

支原體實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法大PK

支原體常規(guī)檢測(cè)方法匯總（一）

支原體常規(guī)檢測(cè)方法匯總（二）

支原體常規(guī)檢測(cè)方法匯總（三）

支原體常規(guī)檢測(cè)方法匯總（四）

總結(jié)一下：

支原體污染鑒定：

推薦使用穩(wěn)定可靠的支原體檢測(cè)試劑盒，這里以經(jīng)典法試劑盒：Venor?Gem qEP（貨號(hào)：11-9025/11-9100/11-9250）為例：

1、樣品制備：

①濃縮：當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)至90%時(shí)，即可收集上清開始檢測(cè)，可對(duì)樣品進(jìn)行適當(dāng)濃縮。

注：濃縮僅適用于支原體的完整性，避免濃縮前支原體被破壞（如熱滅活）。

②穩(wěn)定：細(xì)胞培養(yǎng)樣品可能含有豐富的DNA酶，在低溫下也能降解支原體DNA。因而推薦進(jìn)行樣品穩(wěn)定化處理。如果立即進(jìn)行DNA抽提，則忽略這一步。

③DNA 抽提：大量證據(jù)表明，DNA抽提可實(shí)現(xiàn)最高的靈敏度。DNA抽提有多種方法，但應(yīng)適合支原體基因組。

我們推薦：

Venor?GeM Sample Preparation kits （貨號(hào)56-1010/-1050/-1200) 適合手動(dòng)DNA抽提。

這些DNA抽提試劑盒已經(jīng)過(guò)大量驗(yàn)證，具體流程參見試劑盒說(shuō)明書。另外Venor?GeM qEP kit包含的內(nèi)控DNA對(duì)照，也用于驗(yàn)證DNA抽提步驟（內(nèi)控原理：已知濃度的細(xì)胞，包含內(nèi)部控制DNA序列，該序列不和現(xiàn)有的任何有機(jī)體序列同源，對(duì)檢測(cè)的DNA樣品干擾極小。在DNA提取前，將該內(nèi)控細(xì)胞和樣品一起加入細(xì)胞裂解液中，被一起提取出來(lái)。和靶點(diǎn)樣品一起進(jìn)行熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)，內(nèi)控DNA序列的成功擴(kuò)增提示靶點(diǎn)DNA的提取成功）。

二、試劑制備與PCR

注：具體參數(shù)設(shè)置可點(diǎn)擊閱讀原文，登錄締一官方網(wǎng)站進(jìn)行查詢

另外，下列儀器已經(jīng)通過(guò)PCR反應(yīng)驗(yàn)證：

3、結(jié)果分析

FAM通道檢測(cè)支原體熒光信號(hào)。依據(jù)DNA標(biāo)準(zhǔn)曲線和Ct值定量。具體步驟需參考具體qPCR 儀及軟件的功能。我們推薦對(duì)包括對(duì)照在內(nèi)的每個(gè)樣品的擴(kuò)增曲線進(jìn)行評(píng)估。

Ct＜40為陽(yáng)性結(jié)果。Ct≥40為陰性結(jié)果。支原體DNA和內(nèi)控DNA存在信號(hào)的競(jìng)爭(zhēng)性抑制。支原體DNA越多，F(xiàn)AM通道信號(hào)越高，檢測(cè)內(nèi)控對(duì)照的HEX通道信號(hào)越低。

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