細(xì)胞培養(yǎng)中的污染監(jiān)控與檢測——支原體

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三、支原體污染

支原體概述：

支原體（mycoplasma）是一類沒有細(xì)胞壁、高度多形性、能通過濾菌器、可用人工培養(yǎng)基培養(yǎng)增殖的最小原核細(xì)胞型微生物，大小為0.1～0.3微米。由于能形成絲狀與分枝形狀，故稱為支原體。

在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，顯微鏡很難捕捉到它們的身影，與細(xì)胞競爭營養(yǎng)，影響細(xì)胞生長，最終導(dǎo)致實驗出現(xiàn)偏差。

支原體污染癥狀：

在往期文章中，有介紹過如何鑒定支原體污染的，戳戳下方鏈接一起回顧

DIY判斷細(xì)胞的支原體污染

支原體實驗室檢測方法大PK

支原體常規(guī)檢測方法匯總（一）

支原體常規(guī)檢測方法匯總（二）

支原體常規(guī)檢測方法匯總（三）

支原體常規(guī)檢測方法匯總（四）

總結(jié)一下：

支原體污染鑒定：

推薦使用穩(wěn)定可靠的支原體檢測試劑盒，這里以經(jīng)典法試劑盒：Venor?Gem qEP（貨號：11-9025/11-9100/11-9250）為例：

1、樣品制備：

①濃縮：當(dāng)細(xì)胞長至90%時，即可收集上清開始檢測，可對樣品進(jìn)行適當(dāng)濃縮。

注：濃縮僅適用于支原體的完整性，避免濃縮前支原體被破壞（如熱滅活）。

②穩(wěn)定：細(xì)胞培養(yǎng)樣品可能含有豐富的DNA酶，在低溫下也能降解支原體DNA。因而推薦進(jìn)行樣品穩(wěn)定化處理。如果立即進(jìn)行DNA抽提，則忽略這一步。

③DNA 抽提：大量證據(jù)表明，DNA抽提可實現(xiàn)最高的靈敏度。DNA抽提有多種方法，但應(yīng)適合支原體基因組。

我們推薦：

Venor?GeM Sample Preparation kits （貨號56-1010/-1050/-1200) 適合手動DNA抽提。

這些DNA抽提試劑盒已經(jīng)過大量驗證，具體流程參見試劑盒說明書。另外Venor?GeM qEP kit包含的內(nèi)控DNA對照，也用于驗證DNA抽提步驟（內(nèi)控原理：已知濃度的細(xì)胞，包含內(nèi)部控制DNA序列，該序列不和現(xiàn)有的任何有機體序列同源，對檢測的DNA樣品干擾極小。在DNA提取前，將該內(nèi)控細(xì)胞和樣品一起加入細(xì)胞裂解液中，被一起提取出來。和靶點樣品一起進(jìn)行熒光定量PCR實驗，內(nèi)控DNA序列的成功擴增提示靶點DNA的提取成功）。

二、試劑制備與PCR

注：具體參數(shù)設(shè)置可點擊閱讀原文，登錄締一官方網(wǎng)站進(jìn)行查詢

另外，下列儀器已經(jīng)通過PCR反應(yīng)驗證：

3、結(jié)果分析

FAM通道檢測支原體熒光信號。依據(jù)DNA標(biāo)準(zhǔn)曲線和Ct值定量。具體步驟需參考具體qPCR 儀及軟件的功能。我們推薦對包括對照在內(nèi)的每個樣品的擴增曲線進(jìn)行評估。

Ct＜40為陽性結(jié)果。Ct≥40為陰性結(jié)果。支原體DNA和內(nèi)控DNA存在信號的競爭性抑制。支原體DNA越多，F(xiàn)AM通道信號越高，檢測內(nèi)控對照的HEX通道信號越低。

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