qPCR（熒光定量PCR）實驗步驟

qPCR實驗，即熒光定量PCR實驗，其步驟主要包括試劑耗材準(zhǔn)備、RNA提取和反轉(zhuǎn)錄、體系配制以及上機操作。以下是詳細(xì)的步驟說明：

試劑耗材準(zhǔn)備：確保實驗所需的八聯(lián)管和槍頭無酶無菌，鑷子提前進行高壓處理，加樣所用的金屬托架應(yīng)提前放置在冰箱中降溫。

RNA提取和反轉(zhuǎn)錄：這一步需要在低溫條件下進行。使用Trizol進行RNA提取時，要注意蛋白質(zhì)層的分離。Mix配置后應(yīng)避免反復(fù)凍融，并注意防止空氣中的小片段核酸污染。RNA提取后應(yīng)盡快進行反轉(zhuǎn)錄，不宜久放。

體系配制：在配制體系時，應(yīng)確保在避光條件下進行。每個樣品應(yīng)設(shè)置3個平行孔，以保證數(shù)據(jù)的真實性和可用性。如果同一樣本的核酸分裝在多個小EP管中，建議在配制體系時盡量將這些核酸轉(zhuǎn)移至一個管中混勻后再加樣，以保證平行孔間的數(shù)據(jù)穩(wěn)定性。

上機操作：在上機前，應(yīng)先對樣本進行離心處理。如果管內(nèi)有氣泡，可以用手指輕彈以去除。加完樣后，樣本不能久置，應(yīng)立即進行上機操作。

除了上述主要步驟外，實驗過程中還需要注意一些細(xì)節(jié)，如引物的設(shè)計。引物的設(shè)計應(yīng)遵循一些原則，如擴增產(chǎn)物長度應(yīng)在80-150bp之間，堿基應(yīng)隨機分布，引物長度應(yīng)在30-45bp之間，且5’端不應(yīng)是G，因為G有淬滅作用，可能會影響定量結(jié)果。

另外，由于實時定量PCR實驗的靈敏度高，因此每個樣品至少需要做3個平行孔，以防止在后續(xù)的數(shù)據(jù)分析中由于Ct值相差較大或SD值過大而無法進行統(tǒng)計分析。

請注意，實驗的具體步驟可能因?qū)嶒災(zāi)康摹颖绢愋鸵约八褂玫脑噭┖蛢x器而有所不同。因此，在進行實驗前，建議仔細(xì)閱讀相關(guān)試劑和儀器的說明書，并遵循實驗室的操作規(guī)程。