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qPCR(熒光定量PCR)實驗步驟

2024-03-07 16:32

qPCR實驗,即熒光定量PCR實驗,其步驟主要包括試劑耗材準(zhǔn)備、RNA提取和反轉(zhuǎn)錄、體系配制以及上機操作。以下是詳細(xì)的步驟說明:

試劑耗材準(zhǔn)備:確保實驗所需的八聯(lián)管和槍頭無酶無菌,鑷子提前進行高壓處理,加樣所用的金屬托架應(yīng)提前放置在冰箱中降溫。

RNA提取和反轉(zhuǎn)錄:這一步需要在低溫條件下進行。使用Trizol進行RNA提取時,要注意蛋白質(zhì)層的分離。Mix配置后應(yīng)避免反復(fù)凍融,并注意防止空氣中的小片段核酸污染。RNA提取后應(yīng)盡快進行反轉(zhuǎn)錄,不宜久放。

體系配制:在配制體系時,應(yīng)確保在避光條件下進行。每個樣品應(yīng)設(shè)置3個平行孔,以保證數(shù)據(jù)的真實性和可用性。如果同一樣本的核酸分裝在多個小EP管中,建議在配制體系時盡量將這些核酸轉(zhuǎn)移至一個管中混勻后再加樣,以保證平行孔間的數(shù)據(jù)穩(wěn)定性。

上機操作:在上機前,應(yīng)先對樣本進行離心處理。如果管內(nèi)有氣泡,可以用手指輕彈以去除。加完樣后,樣本不能久置,應(yīng)立即進行上機操作。

除了上述主要步驟外,實驗過程中還需要注意一些細(xì)節(jié),如引物的設(shè)計。引物的設(shè)計應(yīng)遵循一些原則,如擴增產(chǎn)物長度應(yīng)在80-150bp之間,堿基應(yīng)隨機分布,引物長度應(yīng)在30-45bp之間,且5’端不應(yīng)是G,因為G有淬滅作用,可能會影響定量結(jié)果。

另外,由于實時定量PCR實驗的靈敏度高,因此每個樣品至少需要做3個平行孔,以防止在后續(xù)的數(shù)據(jù)分析中由于Ct值相差較大或SD值過大而無法進行統(tǒng)計分析。

請注意,實驗的具體步驟可能因?qū)嶒災(zāi)康摹颖绢愋鸵约八褂玫脑噭┖蛢x器而有所不同。因此,在進行實驗前,建議仔細(xì)閱讀相關(guān)試劑和儀器的說明書,并遵循實驗室的操作規(guī)程。


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