從HiFi測序角度解惑細(xì)胞與基因治療的神話

細(xì)胞和基因治療研究對生物制藥開發(fā)至關(guān)重要，HiFi長讀測序在整個過程中顯著增強了許多測序應(yīng)用。盡管AAV測序是基因組學(xué)的最新應(yīng)用之一，但它也是當(dāng)今疾病研究中最有前途的應(yīng)用之一。腺相關(guān)病毒(Adeno-associated virus, AAV)是在基因治療載體上實驗最活躍的病毒之一使用AAV的基因療法和CAR-T等細(xì)胞療法有可能治愈以前無法治愈的疾病。尤其是CAR-T細(xì)胞癌癥治療，在對抗這種毀滅性疾病方面顯示出巨大的希望。2023年，FDA批準(zhǔn)了幾種新的基于AAV的療法和基于細(xì)胞的基因療法，用于治療杜氏肌營養(yǎng)不良癥、嚴(yán)重血友病A和鐮狀細(xì)胞病。

AAV載體的設(shè)計對基因治療研究產(chǎn)生了影響，這可能是對抗這些疾病的最后一站，也許還有更多。高度精確的長讀測序支持研究設(shè)計、驗證和優(yōu)化使用這種病毒載體的潛在基因療法。

載體設(shè)計在基因治療開發(fā)的成功中起著至關(guān)重要的作用。在細(xì)胞和基因治療中，安全性是最重要的，研發(fā)過程也非常漫長，意想不到的錯誤可能會迅速破壞多年的工作，可能會推遲那些需要挽救生命的治療。全面準(zhǔn)確地描述AAV產(chǎn)品的特征可以降低臨床試驗中代價高昂的失敗風(fēng)險。

全面了解靶標(biāo)編輯和脫靶編輯、載體或構(gòu)建體整合以及插入突變是驗證AAV產(chǎn)品設(shè)計和確保其可制造性的關(guān)鍵組成部分。使用特殊的精度和長度的HiFi讀數(shù)意味著你可以對你的產(chǎn)品設(shè)計充滿信心，避免意外的支線。

高保真閱讀器對組裝基因組很有好處，這是真的，但它們能做的遠不止這些。

細(xì)胞計數(shù)和基因治療研究是HiFi測序的眾多應(yīng)用之一。無論是全長AAV測序，基因編輯評估，質(zhì)?；驍U增子庫篩選，還是載體整合，>20 kb reads和99.9%準(zhǔn)確率的HiFi的成功組合都可以讓您檢測短讀測序可能錯過的變體或事件。

你可以在AAV基因治療發(fā)展的每個研究階段使用HiFi測序:發(fā)現(xiàn)AAV載體:通過靶向測序發(fā)現(xiàn)新的衣殼。優(yōu)化AAV載體設(shè)計:通過觀察截斷、碎片和其他非全長異常的頻率來改進設(shè)計。

確認(rèn)mRNA轉(zhuǎn)錄本:通過全長同種異構(gòu)體測序量化同種異構(gòu)體。

研究宿主整合:了解這些事件的頻率，以確保產(chǎn)品的潛在安全性和有效性?確保AAV生產(chǎn)的質(zhì)量比較載體和未解析的基因組，并評估由不同平臺制作的載體準(zhǔn)備

那么基因編輯呢?HiFi測序可以通過以下方式為你的基因編輯研究提供動力:評估基因插入CRISPR目標(biāo)位點導(dǎo)致的indel和其他突變?檢測罕見的脫靶突變。了解在等位基因特異性Cas9切割的情況下單倍型和SNVs對基因編輯的影響?通過使用無擴增方法避免PCR偏差和局限性

3:準(zhǔn)確性對于表征AAV雜質(zhì)并不那么重要，比如部分基因組。

在所有科學(xué)領(lǐng)域，準(zhǔn)確性都是至關(guān)重要的，在細(xì)胞和基因治療研究中，這種風(fēng)險可以說更高，因為臨床試驗、患者結(jié)果和改變生活的治療方法都處于危險之中。

借助高精度的HiFi長讀數(shù)，您可以評估AAV中的雜質(zhì)，如部分基因組，同時獲得有關(guān)序列一致性的關(guān)鍵信息。PacBio HiFi測序?qū)㈤L讀數(shù)的優(yōu)勢與桑格水平的準(zhǔn)確性結(jié)合起來。這意味著您可以使用一種技術(shù)來監(jiān)控和改進AAV的發(fā)現(xiàn)和制造，降低成本高昂的故障風(fēng)險，從而將開發(fā)時間表推遲數(shù)月甚至數(shù)年。

缺少關(guān)于矢量質(zhì)量的關(guān)鍵信息可能會影響設(shè)計的有效性。

4:配對納米孔與是最簡單的方法來表征AAV從倒置串聯(lián)重復(fù)序列(ITR)到ITR。

事實:這種說法是短視的。

ONT和short-reads都不能完全解析ITRs，使用short-reads時需要額外的生物信息學(xué)比對工作。當(dāng)你能做得更好的時候，為什么要進行多次分析?高度精確的長讀測序結(jié)合了準(zhǔn)確度和閱讀長度，你需要在一個實驗。永遠不要再因為精確度太低或太短而無法對齊而丟棄讀取。此外，具有HiFi讀數(shù)的長讀段測序支持廣泛的應(yīng)用，這些應(yīng)用對細(xì)胞和基因治療產(chǎn)品的設(shè)計和開發(fā)至關(guān)重要，包括:AAV測序、基于擴增子的構(gòu)建篩選、基因編輯和靶向和脫靶評估、全長質(zhì)粒測序、載體整合、RNA測序和全基因組測序。

5:AAV復(fù)雜到難以使用PacBio HiFi測序。

事實:這種說法不正確。

PacBio和Form Bio的合作伙伴為AAV測序和數(shù)據(jù)分析提供端到端的工作流程，在一個一體化的解決方案中優(yōu)化您的AAV載體設(shè)計。該工作流程適用于使用相同協(xié)議的ssAAV和scAAV測序。Form Bio工作流程經(jīng)過PacBio認(rèn)證兼容，并提供分析軟件來幫助您分析和可視化AAV數(shù)據(jù)，從而節(jié)省時間和資源。