支原體污染pcr檢測步驟

支原體污染PCR檢測步驟主要包括樣品收集與處理、DNA提取、PCR反應體系配置、PCR擴增、瓊脂糖凝膠電泳以及結果分析等幾個關鍵步驟。以下是詳細的步驟說明：

一、樣品收集與處理

樣品收集：

收集待測細胞系的培養(yǎng)上清液，通常是在細胞培養(yǎng)后的一段時間（如3-7天）進行收集。

確保在收集樣品前數(shù)天或至少在解凍后兩周內，沒有加入任何抗生素，以保證支原體在培養(yǎng)上清中的效價在PCR測定范圍之內。

樣品處理：

將收集到的培養(yǎng)上清液進行離心處理，以去除細胞碎片和其他雜質。

使用適當?shù)木彌_液（如D-PBSA）重懸沉淀，并進行多次洗滌，以進一步純化樣品。

二、DNA提取

加熱處理：

將處理后的樣品加熱至一定溫度（如90°C）并保持一段時間（如15分鐘），以裂解細胞并釋放DNA。

DNA抽提：

采用標準的DNA抽提方法（如酚/氯仿抽提法、乙醇沉淀法等）從樣品中提取DNA。

注意避免交叉污染，確保DNA的純度。

三、PCR反應體系配置

準備反應液：

根據(jù)PCR試劑盒的說明或實驗室的標準流程，配置PCR反應液。

通常包括引物、dNTPs、Taq DNA聚合酶、緩沖液等必要成分。

加入模板DNA：

將提取的DNA作為模板加入到PCR反應液中。

注意控制DNA的加入量，避免過多或過少。

四、PCR擴增

設置PCR程序：

根據(jù)實驗需要設置合適的PCR擴增程序，包括預變性、變性、退火、延伸等步驟。

通常包括一個初始的預變性步驟（如95°C，7分鐘），隨后是多個循環(huán)的變性（如95°C，4秒）、退火（如65°C，8秒）和延伸（如72°C，16秒）步驟，每個循環(huán)的延伸時間可以逐漸增加。

進行PCR擴增：

將配置好的PCR反應液放入PCR儀中，按照設定的程序進行擴增。

注意監(jiān)控PCR儀的運行狀態(tài)，確保擴增過程順利進行。

五、瓊脂糖凝膠電泳

制備瓊脂糖凝膠：

根據(jù)實驗需要制備適當濃度的瓊脂糖凝膠（如2%），并加入適量的電泳緩沖液。

點樣與電泳：

將PCR擴增產物與適量的加樣緩沖液混合后，點樣到瓊脂糖凝膠的孔中。

在電泳儀上進行電泳，通常使用恒壓或恒流模式進行電泳。

六、結果分析

觀察電泳結果：

在紫外燈下觀察瓊脂糖凝膠上的電泳條帶。

注意比較樣品條帶與陽性對照、陰性對照條帶的位置和亮度。

判斷結果：

如果樣品條帶出現(xiàn)在陽性對照條帶相同的位置，且亮度相近或稍弱，則可判斷為支原體污染陽性。

如果樣品條帶未出現(xiàn)或位置與陽性對照條帶明顯不同，則可判斷為支原體污染陰性或假陰性。

需要注意的是，PCR檢測支原體污染具有高度的靈敏性和特異性，但也可能受到實驗條件、操作技術等多種因素的影響。因此，在進行PCR檢測時，應嚴格遵守實驗操作規(guī)程，確保實驗結果的準確性和可靠性。