生物制品中支原體檢測的方法

生物制品中支原體檢測的方法主要包括以下幾種：

一、培養法

原理：從樣品細胞培養體系中取樣，接種到適宜支原體生長的瓊脂平板上。如果樣本中含有支原體，它們就會在這種瓊脂平板上生長，最終形成明顯可見的特征性菌落。

優點：操作規范的情況下，很少會出現假陰性結果，檢測精確度很高，因此被譽為支原體檢測金標準，也是《美國藥典》中認可的支原體檢測方法之一。

缺點：

檢測時間較長，支原體要長出明顯克隆至少需要4周時間。

無法對曾經感染過的樣品做出判斷。

能鑒定的支原體種類有限，例如支原體M. Hyorhinis等無法被檢測出來。

二、指示細胞法（DNA染色法）

原理：將供試品接種于無污染、標準化的指示細胞（如Vero細胞或經國家藥品檢定機構認可的其他細胞）中培養，然后用特異熒光染料進行染色。支原體中的核酸可以被著色，如果待檢測細胞中含有支原體，就會導致指示細胞被感染，進而在細胞膜或培養基等處發現藍色熒光。

優點：

可用于檢測一些不易培養的支原體，如豬鼻支原體。

耗時較短，同時可對多個樣品進行檢測。

缺點：

存在假陽性和假陰性的可能。例如，一些死亡細胞釋放出來的DNA會被染成藍色，導致假陽性；或由于熒光過弱而出現假陰性，使結果出現偏差。

口腔支原體和精氨酸支原體對細胞或蓋玻片吸附能力較差，容易出現檢測時的假陰性。

三、核酸法

原理：通過對樣品中可能存在的支原體DNA進行擴增并檢測，來判斷樣品是否被支原體污染。常用的核酸法主要有常規PCR法和熒光定量PCR法（qPCR）。

優點：

快速、敏感、方便，可實現對生物制品生產中所需的大部分原輔材料和半成品的支原體檢驗。

qPCR法還具有較高的特異性和靈敏度，且易于自動化操作。

缺點：

qPCR法檢測支原體的能力依賴于擴增引物序列的廣泛性和特異性，不同的核酸提取方法、擴增反應體系及擴增程序可能會對陽性樣本的檢出效率產生影響。

qPCR法檢出的是支原體的基因組，無法鑒別樣品中的支原體是否存活或是否為支原體相近種屬的微生物污染。因此，需要進行方法學驗證。

四、ELISA法

原理：基于抗原與抗體特異性結合的原理，通過檢測樣品中支原體特異性抗體或抗原的存在來判斷支原體感染情況。

優點：操作簡單、特異性和敏感性均比較強。

缺點：對檢測環境和儀器的要求較高，容易發生交叉感染。

五、其他方法

除了上述方法外，還有一些其他方法如高通量測序（NGS）法、激光力細胞學（LFC）法等，這些方法在靈敏度、簡便性和快捷性方面可能具有優勢，但需要經過驗證后才能考慮作為支原體檢測的補充方法。

總的來說，在選擇支原體檢測方法時，應根據實際的應用場景、檢測需求以及成本等因素進行綜合考慮。同時，為確保檢測結果的準確性和可靠性，還應嚴格按照相關法規和標準進行操作和驗證。