新技術(shù)揭示新生兒免疫系統(tǒng)發(fā)育模式

2018年，拓展質(zhì)譜流式應(yīng)用方向的文獻(xiàn)頻出。5月斯坦福大學(xué)Alex J. Kuo實(shí)驗(yàn)室將質(zhì)譜流式研究引入表觀修飾領(lǐng)域和衰老領(lǐng)域的熱潮還未過去，8月瑞典皇家理工學(xué)院Petter Brodin實(shí)驗(yàn)室就實(shí)力搶鏡，在Cell上發(fā)表其研究“Stereotypic Immune System Development in Newborn Children”，將質(zhì)譜流式的熱潮延續(xù)到新生兒免疫系統(tǒng)發(fā)育領(lǐng)域。接下來就讓小編帶著您一探究竟。

免疫系統(tǒng)的發(fā)育依賴于其暴露的環(huán)境因素。尤其是新生兒誕生后的前三個(gè)月暴露于什么樣的環(huán)境中對(duì)于其免疫系統(tǒng)發(fā)育有重要的影響：腸道，皮膚，血管的微生物組成都在其中扮演了重要的角色。在此期間的免疫系統(tǒng)發(fā)育情況與后期過敏，哮喘，I型糖尿病等免疫相關(guān)疾病的發(fā)病都有相關(guān)性。因此，新生兒免疫系統(tǒng)發(fā)育一直以來都備受重視卻又難有突破。其中很重要的一個(gè)原因是研究存在一個(gè)技術(shù)難點(diǎn)，那就是如何從新生兒如此少的血樣中得到足夠多的信息。在本文中，Petter Brodin實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用了質(zhì)譜流式技術(shù)（每次可以檢測(cè)40個(gè)通道以上）和ProSeek（Immunoassays，分析267種血漿蛋白）高通量的優(yōu)勢(shì)，克服這一難點(diǎn)。

該研究抽取了50個(gè)早產(chǎn)兒(＜30周)和50個(gè)足月新生兒(＞37周)出生時(shí)的臍帶血及出生后1周、4周和12周的僅僅100ul血液，利用質(zhì)譜流式技術(shù)就分析了58個(gè)常見免疫細(xì)胞亞群在人出生后不同時(shí)間點(diǎn)的發(fā)育情況，對(duì)比分析了早產(chǎn)兒和足月出生的新生兒之間的關(guān)系，并對(duì)影響免疫發(fā)育的因素進(jìn)行了研究(圖一)。同時(shí)結(jié)合immunoassays Proseek分析267種血漿蛋白表達(dá)情況，系統(tǒng)性呈現(xiàn)出新生兒出生后免疫系統(tǒng)適應(yīng)性發(fā)育概況。結(jié)果顯示：1 早產(chǎn)兒和足月新生兒在出生后免疫系統(tǒng)組成有著較大差異，之后，隨著免疫系統(tǒng)的發(fā)育，兩者的差異逐漸消失；2 免疫系統(tǒng)最初的發(fā)育遵循一個(gè)既定的路線；3 臍帶血的免疫亞群組成對(duì)于新生兒的免疫系統(tǒng)無預(yù)示作用；4 與微生物的相互作用對(duì)免疫系統(tǒng)的發(fā)育有重要影響，腸道微生物的失調(diào)會(huì)阻礙發(fā)育進(jìn)程。

圖一:文章研究思路. 采用50個(gè)早產(chǎn)兒和50個(gè)足月新生兒出生時(shí)的臍帶血及出生后的1周，4周和12周的100ul血液，利用質(zhì)譜流式技術(shù)和Proseek對(duì)新生兒免疫系統(tǒng)發(fā)育以及環(huán)境對(duì)其的影響進(jìn)行解析.

該研究對(duì)于質(zhì)譜流式應(yīng)用具有很大的推進(jìn)作用——將樣本量降低到僅僅100ul，而且在降低樣本量的同時(shí)還可以維系PBMC分群得到常見免疫亞群中最為稀少的DC細(xì)胞亞群。其改良后的Protocol對(duì)于今后質(zhì)譜流式的應(yīng)用，尤其是樣本量稀少的研究很有借鑒意義。該P(yáng)rotocol采用SmartTube或Cytodelics系列產(chǎn)品直接對(duì)血樣進(jìn)行裂紅的方法代替常規(guī)Ficoll分離，降低了分離時(shí)所損失的細(xì)胞比例，提高了得率及活細(xì)胞比率。因此100ul血樣中的PBMC就足以在保證罕見免疫亞群不丟失的情況下完成分群。在這里需要提出的一點(diǎn)是該P(yáng)rotocol的成功應(yīng)用同時(shí)得益于其Panel設(shè)計(jì)。由于研究的是常見免疫亞群的發(fā)育情況，Panel中所涉及到的38種marker都是T細(xì)胞，B細(xì)胞，NK細(xì)胞，DC細(xì)胞等亞群激活，分化等分群常見的表面蛋白，而沒有涉及到信號(hào)會(huì)受到SmartTube影響的趨化因子受體，磷酸化蛋白等抗原(圖二)。用Immunoassay作為手段進(jìn)行趨化因子等蛋白濃度研究。

圖二:質(zhì)譜流式Panel.

在研究的一開始，作者對(duì)早產(chǎn)兒和足月兒的臍帶血中血漿蛋白濃度進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)早產(chǎn)兒的臍帶血中的免疫系統(tǒng)有明顯炎癥反應(yīng)特征：趨化因子CXCL11和IL8（CXCL8）高表達(dá).而足月兒臍帶血中存在adipokine leptin高表達(dá)，反映在孕期的最后三個(gè)月，胎兒體內(nèi)進(jìn)行大量的脂肪累積。臍帶血的質(zhì)譜流式分析顯示早產(chǎn)兒和足月兒的免疫系統(tǒng)組成具有各自明顯的特征：其主要的區(qū)別在于早產(chǎn)兒體內(nèi)的嗜中性粒細(xì)胞比例偏低。之后作者對(duì)新生兒臍帶血(或外周血)和出生后一周的嬰兒血樣中免疫系統(tǒng)進(jìn)行相關(guān)系數(shù)分析，發(fā)現(xiàn)在分析的21個(gè)亞群中，只有6個(gè)亞群顯示出相關(guān)性。在分析的81種血漿蛋白中，只有TNFRSF13B可以由臍帶血進(jìn)行預(yù)測(cè)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證兩者相關(guān)性，作者采用Barnes-Hut SNE (bhSNE)和Jensen-Shannon距離(JS Distance)分析，發(fā)現(xiàn)無論是細(xì)胞組成，血漿蛋白濃度還是細(xì)胞表型都無法由臍帶血作出預(yù)測(cè)。為了進(jìn)一步研究整個(gè)免疫系統(tǒng)的發(fā)育過程，作者采用拓?fù)鋽?shù)據(jù)分析(TDA)對(duì)免疫系統(tǒng)發(fā)育初期的細(xì)胞頻率，血漿蛋白濃度等各類數(shù)據(jù)進(jìn)行綜合系統(tǒng)性降維分析，使其可視化，并結(jié)合臨床數(shù)據(jù)，比如妊娠年齡，分析他們的關(guān)聯(lián)性。之后結(jié)合皮爾遜相關(guān)系數(shù)分析，創(chuàng)建了KNN圖譜。這些分析得出無監(jiān)管計(jì)算模式下免疫系統(tǒng)發(fā)育的多參數(shù)圖譜。該圖譜中，臍帶血和新生兒外周血的簇群完全分離，說明臍帶血和出生后免疫系統(tǒng)發(fā)育無相關(guān)性(原文Figure3A)。早產(chǎn)兒和足月兒的簇群在一開始完全分離，說明在出生時(shí)兩者有著完全不同的免疫系統(tǒng)狀態(tài)，但是隨著年齡的增長(zhǎng)，這些分支逐漸完全重疊，說明盡管起點(diǎn)不同，但兩者的發(fā)育遵循著共有的軌道(原文Figure3B)。

作者運(yùn)用ANOVA模式分析了臍帶血和出生后不同時(shí)間點(diǎn)的血樣中的10個(gè)主要免疫亞群，發(fā)現(xiàn)隨著出生時(shí)間的延長(zhǎng)，免疫發(fā)育遵循了相同的系統(tǒng)變化：嗜中性粒細(xì)胞的梯度遞減和Na?ve CD4、CD8陽(yáng)性T細(xì)胞的增加(原文Figure4B)。跟臍帶血比起來，新生兒的負(fù)向調(diào)控免疫亞群比如MDSC類似亞群逐漸減少。以上這些發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步表明，無論是早產(chǎn)兒還是足月兒，出生后免疫系統(tǒng)的發(fā)育都系統(tǒng)性遵循著類似的軌跡。

之后作者關(guān)心的一個(gè)問題是出生后前三個(gè)月新生兒暴露的環(huán)境因素，對(duì)于免疫系統(tǒng)發(fā)育的影響。因此作者下一步的研究是將新生兒不同發(fā)育時(shí)期的血樣分別和其父母血樣用bhSNE進(jìn)行研究對(duì)比。發(fā)現(xiàn)如下，在出生時(shí)，新生兒體內(nèi)的單核細(xì)胞表型跟其父母已無明顯差異，之后隨著發(fā)育的進(jìn)程，Na?ve B，NK細(xì)胞和DC細(xì)胞的表型差異逐漸消失，但是CD4、CD8陽(yáng)性T細(xì)胞表型在研究所涉及的發(fā)育時(shí)間內(nèi)依舊存在差異。這預(yù)示著不同免疫亞群發(fā)育遵循各自不同的軌道，出生后前三個(gè)月暴露于什么樣的環(huán)境中對(duì)于Na?ve B，NK細(xì)胞和DC細(xì)胞發(fā)育具有長(zhǎng)期的影響。

文章結(jié)合多種高通量的研究方法，站在系統(tǒng)性的高度上，對(duì)于新生兒免疫系統(tǒng)發(fā)育過程進(jìn)行細(xì)致研究。除了質(zhì)譜流式技術(shù)以外，文中還采用了其他的一些研究方法，比如16s RNA Profiling研究腸道微生物對(duì)于免疫系統(tǒng)發(fā)育的影響，RNASeq對(duì)1周和12周的嬰兒血液樣本進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析等。結(jié)合所有發(fā)現(xiàn)，作者提出了一個(gè)環(huán)境因素如何影響免疫系統(tǒng)發(fā)育的假說(圖三)。假設(shè)對(duì)于免疫系統(tǒng)輸入一個(gè)刺激，誘發(fā)免疫系統(tǒng)整體會(huì)往一個(gè)方向做出反應(yīng)。在此背景下，輸入第二個(gè)與**個(gè)刺激引發(fā)相反反應(yīng)的刺激后，免疫系統(tǒng)會(huì)做出針對(duì)兩個(gè)刺激的反應(yīng)，但是這兩種反應(yīng)彼此限制。那么，如果刺激足夠多，引發(fā)的表型可能性會(huì)減少，發(fā)育軌跡便可以預(yù)測(cè)。

圖三: 新生兒免疫系統(tǒng)發(fā)育假說